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1、PCR 引物设计基本思路1. 根据实验需要，确定需要扩增的 DNA 序列，并知道其 CDS 区序列（编码结构基因区,即从起始密码子区至终止密码子区）ncbi网站查询RBS149.153/gene=eryFCDS158.1372/gene=eryF1 ggatcccgat cgtgtcggag gaagaggcca agtcgcgccg ccccgaccag ctgctggtgc61 tgccctggat ctaccgcgac gggttcgtcg aacgcgagca ggagttcctc gctggcggcg121 gaaagctgat cttcccccta ccccgactgg aagtc
2、gt atg acgaccgttc ccgatctcga181 aagcgactcc ttccacgtcg actggtaccg cacctacgcc gagctgcgcg agaccgcgcc241 ggtgacgccg gtgcgcttcc tcggccagga cgcgtggctg gtcaccggct acgacgaggc301 gaaggccgcg ctgagcgacc tgcgcctgag cagcgacccg aagaagaagt acccgggcgt361 ggaggtcgag ttcccggcat acctcggttt ccccgaggac gtgcggaact acttcg
3、ccac421 caacatgggc accagcgacc cgccgaccca cacccggctg cgcaagctgg tgtcgcagga481 gttcaccgtc cgccgcgtgg aggcgatgcg gccccgcgtc gagcagatca ccgcggagct541 gctcgacgag gtgggcgact ccggcgtggt cgacatcgtc gaccgcttcg cccacccgct601 gcccatcaag gtcatctgcg agctgctcgg cgtcgacgag aagtaccgcg gggagttcgg661 gcggtggagc tcgga
4、gatcc tggtcatgga cccggagcgg gccgaacagc gcgggcaggc721 ggccagggag gtcgtcaact tcatcctcga cctggtcgag cgccgccgca ccgagcccgg781 cgacgacctg ctgtccgcgc tgatcagggt ccaggacgac gatgacggtc ggctcagcgc841 cgacgagctg acctccatcg cgctggtgct gctgctggcc ggtttcgagg cgtcggtgag901 cctcatcggg atcggcacct acctgctgct cacccac
5、ccg gaccagctcg cgctggtgcg961 gcgggacccg tcggcgctgc ccaacgccgt cgaggagatc ctgcgctaca tcgctccgcc 1021 ggagaccacc acgcgcttcg ccgcggagga ggtggagatc ggcggtgtcg cgatccccca 1081 gtacagcacg gtgctggtcg cgaacggcgc ggccaaccgc gacccgaagc agttcccgga 1141 cccccaccgc ttcgacgtca cccgcgacac ccgcggccac ctgtcgttcg ggc
6、agggcat 1201 ccacttctgc atgggccggc cgctggccaa gctggagggc gaggtggcgc tgcgggcgct 1261 gttcggccgc ttccccgctc tgtcgctggg aatcgacgcc gacgacgtgg tgtggcggcg 1321 ttcgctgctg ctgcggggca tcgaccacct accggtgcgg ctcgacgga t gagcacctgg 1381 ctgcggcggt tcggtcctcc cgtcgagcac cgggcgcggc tggtgtgctt cccgcacgcg 1441 gg
7、agccgcgg ccgactccta cctcgacctc gcgcgcgcct tggcgcccga gatcgacgtg 1501 cacgccgtgc agtacccggg gcgccaggac cgccgcgacg aggagcccct gggcaccgcc 1561 ggcgagatcg ccgacgaggt ggccgccgtg ctgcgcgcgt cgggcggcga cggcccgttc 1621 gccctgttcg ggcacagcat gggcgcgttg atcgcctacg agacggcgcg caggctcgaa 1681 cgcgagcccg gcggcgg
8、gcc gctgcggctg ttcgtgtccg ggcagaccgc cccgcgcgtg 1741 cacgagcgcc gcaccgacct gcccggcgac gacggtctgg tggacgagct gcgccggctc 1801 ggcaccagcg aggcggcgct ggccgacgag gccctgctcg ccatgtcgct gccggtgctg 1861 cgcgccgact accgcgtgct gcgctcctac gcctgggcgg acggaccacc gctgcgggcc 1921 ggcatcaccg cgctgtgcgg cgacgccgac c
9、cgctgaccg cgaccgggga cgccgagcgc1981 tggttgcagc actcggtcat ccccggccgg accaggacct tccccggcgg gcacttctac 2041 ctgggtgaac aggtcaccga ggtggccggt gccgtgcgcc gggacctgct acgcgccggg 2101 cttgcgggct gaggcgatca cgaagtcgag cgcgggcagc tcgcccttca tgcccgagtc 2161 gctggtcagc gaccgcttga cctggctgta gaagagcctg ctcacgc
10、tct tcttgaacga 2221 ctcgtcctgc aggcacctgg ctg2. 选择所需的载体,确定合适的酶切位点。 所选择的酶切位点尽量为多克隆位点的中间酶切位点，且载体上其它地方无该酶切位 点。这样连接以后再构建新的质粒时选择酶的空间更大些。并保证所需扩增的DNA序列中 无该酶切位点（generuner分析）。Hind IIIpUC182686 bpSphl PstlSallXbal Bam HI Smal IKpnlSac IEcoRIMCS3. 初步确定设计的引物长度。一般为153 Obp，引物过短会影响到扩增的特异性，过长会影响扩增速率。如果扩增 产物W500bp，引
11、物长度为1618bp即可。若扩增产物为45kb，引物最好不要少于24bp。 引物3末端应含有所研究基因特异序列中的173Obp。4.5 正向引物的设计：4.1 酶切位点的位置选择。一般情况下都需要在引物的 5， 3端增加酶切位点，然后利用该 酶将扩增产物切下，接到相应的载体上。A：扩增的DNA用于表达时:(1) 自身有启动子。如：LOCUS VITVHBA 689 bp DNA linear BCT 26-APR-1993 DEFINITION Vitreoscilla sp. hemoglobin (VHb) gene, partial cds.ACCESSIONM30794 M31721
12、X13516VERSIONM30794.1 GI:155319KEYWORDShemoglobin; promoter region.SOURCEVitreoscilla sp.ORGANISMVitreoscilla sp.Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales;Neisseriaceae; Vitreoscilla.REFERENCE1 (bases 42 to 689)AUTHORSKhosla,C. and Bailey,J.E.TITLE The Vitreoscilla hemoglobin gene:
13、molecular cloning, nucleotidesequence and genetic expression in Escherichia coliJOURNALMol. Gen. Genet. 214 (1), 158-161 (1988)MEDLINE89143453PUBMED3067078REFERENCE2 (bases 1 to 210)AUTHORSKhosla,C. and Bailey,J.E.TITLECharacterization of the oxygen-dependent promoter of theVitreoscilla hemoglobin g
14、ene in Escherichia coliJOURNALJ. Bacteriol. 171, 5995-6004 (1989)COMMENTOriginal source text: Vitreoscilla sp. DNA.SWISS-PROT; P04252; BAHG$VITSP.FEATURESLocation/Qualifierssource1.689/organism=Vitreoscilla sp./mol_type=genomic DNA/db_xref=taxon:60misc signal33.40/note=promoter 2-35 signal55.61TO si
15、gnal73.79misc signal86.92/note=promoter 1RBS130.133/note=putative ribosome binding site; putativeCDS142.582/note=hemoglobin/codon_start=1/transl_table=11/protein_id二AAA27585.1/db_xref=GI:155320/translation=MLDQQTINIIKATVPVLKEHGVTITTTFYKNLFAKHPEVRPLFDMGRQESLEQPKALAMTVLAAAQNIENLPAILPAVKKIAVKHCQAGVAAAHYPIVGQEL LGAIKEVLGDAATDDILDAWGKAYGVIADVFIQVEADLYAQAVEORIGIN1 aagcttacag gacgctgggg ttaaaagtat ttgagttttg atgtggatta agttttaaga61 ggcaataaag gtgctgctac accatactga tgtatggcaa aaccataata accatactga121 atgaacttaa ggaagaccct cat
