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1、浙江大学农业与生物技术学院毕业论文（设计）文献综述柑橘发育阶段萜类成分的合成及其相关基因调控的研究学生姓名：汤沁学号：3071601009专业：应用生物科学班级0703指导老师：张波植物萜烯类香气物质形成及TPS基因家族表达的研究1.国内外现状1.1 果品风味研究进展风味能刺激消费者的感官及心理，使各种果品呈现出各自的特征。风味是指品尝过程中嗅觉、味觉和三叉神经感觉的特征的复杂结合，它包括人所能感觉到的食品的香气、味道、口感和外部特征1。香气作为风味指标之一，它的好坏直接影响消费者的购买，目前对果品的香气研究已成为国际上研究的热点之一。1.2 萜烯类物质研究进展植物的香味是由其含有的不同挥发性
2、物质所决定的，构成果实香气的物质主要包括酯类、醇类、醛类、酮类和萜烯类物质2。萜烯类物质是葡萄2、柑橘等3的特征香气物质。1.2.1 物质鉴定与分析进展自20世纪60年代起，气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)开始用于风味的分析1。孙晓萍等4采用常压水蒸气蒸馏的方法，从四川产花椒中提取挥发性成分，并采用气相色谱-质谱联用的方法对其化学成分进行分析鉴定。结果鉴定出47种化合物，占色谱总分出峰的97.75，其中主要为挥发性萜烯类化合物及其衍生物等，占总检出量的89.30。李瑞红5采用顶空固相微萃取和气相色谱-质谱技术，分别鉴定了处于花蕾期、始花期、盛花期和衰老期的白姜花，共鉴定出49种白姜花的香味组
3、分。柑橘类果皮中富含柑橘精油，其主要成分是萜烯类、倍半萜烯类以及高级醇类、醛类、酮类、酯类等组成的含氧化合物，其中90以上是萜烯类和倍半萜烯3。柴静6以我国湖北省具有代表性的优势柑橘品种为研究对象，通过超临界CO2萃取技术对橘皮精油进行提取分离；采用气相色谱-质谱联用技术对不同品质橘皮精油的香气成分作了对比分析；运用高效液相色谱和液相色谱-质谱联用对橘皮精油中黄酮类物质进行了分离鉴定。另外,对柠檬果皮中单萜物质的气相色谱-质谱研究显示，柠檬中单萜物质75%为柠檬烯，11%为-萜品烯，4%为-蒎烯7。1.2.2 生物学功能研究进展人类已经从植物中提取萜烯类物质，并将其广泛用于合成香水、香料、药剂
4、、杀虫剂等制品。作为一种挥发性物质，除了具有巨大的商业价值，萜烯类物质对植物本身也具有重要的生物学作用。它不仅在植物生长发育，如在激素赤霉素的合成中必不可少，而且在植物和环境的相互联系中也起了极其重要的作用8。1.2.2.1抗虫性棉花抗虫萜烯类化合物广泛存在于棉花各组织器官的色素腺内，是棉花中除缩合单宁、黄酮类化合物之外又一类重要的抗虫性次生物质。60年代起就开始了萜烯类化合物对棉花抗虫性能的研究9。1.2.2.2抗逆性萜烯类物质合成前体异戊二烯和单萜烯可以保护植物，避免瞬时高温对光合器官的损害，并能防止光合器官光合能力下降10。1.2.2.3信号作用一些萜烯类物质可作为植物与环境、植物间以及
5、植物器官间的气体信号，这种交流存在于相同品种或不同品种植物间10。1.2.3 物质释放规律研究 梁宝生等11采用流动式采样与气相色谱-质谱联用法研究了意大利撒丁岛Noaks Ark自然生态区主要灌木黄连木（Pistasica lentiscus）萜烯类化合物排特征、排放速率及其日变化。研究发现，萜烯排放速率随温度的升高而增加，并呈指数相关。在姜花中的研究发现，单萜类化合物含量随着花的发育而逐渐增多4。1.3萜烯类合成酶及相关基因的研究进展1.3.1萜烯类物质的合成途径萜烯类化合物是由五碳化合物异戊二烯为结构单位构成的一类化合物，根据数目不同可分为单萜、倍半萜、双萜和三萜。萜烯类合成路径是植物中
6、合成芳香挥发物的主要路径。单萜，双萜和三萜，通常由3-磷酸甘油醛或脱氧-5-磷酸木酮糖(DOXP) 通过异戊萜二磷酸(IPP) 在质体中合成。异戊烯基二磷酸(IPP) 和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP) ，是萜烯类合成共同的前体。在质体和细胞质中分别合成的单萜底物牻牛儿基二磷酸 (GPP) 和倍半萜底物法尼基二磷酸 (FPP)，最后在萜类合成酶( TPS) 的催化下生成各自的产物2。其中，质体的三磷酸甘油醛丙酮酸 (GAP -pyruvate) 途径合成的IPP和DMAPP，通过关键酶1-脱氧木酮酸-5-磷酸酯合成酶 (DXPS)，最终合成异戊烯和单萜；细胞质的乙酸-甲羟戊酸 (acetate
7、-MVA) 途径合成的IPP和DMAPP，主要限速酶为3-羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶 A还原酶 (HMGR)，最终合成倍半萜。（图一）1.3.2萜类合成酶活性及相关基因调控研究进展根据萜烯类合成的基本途径可见，萜类合成酶是合成萜烯类物质的主要酶。在萜类合成酶的研究上，对模式植物如拟南芥、玉米、稻、马铃薯、苜蓿属和云杉属的研究表明，其基因序列和表达序列标签（EST）数据显示存在大量的TPS基因家族成员，对其进化机制及对调控萜烯类物质多样性已有深入研究8。目前，大量萜类合成酶被发现，随着实验技术的提高，例如利用基因组测序获得的信息来进行序列拼接，可获得基因的全长12。在姜花中利用RT-PCR与R
8、ACE相结合的方法，在花中克隆得到一个单萜合成酶基因的cDNA全长序列Hc-monotps，一个萜类合成酶基因Hc-tps1的 3端序列4。Takehiko等从温州蜜柑中分离出四个单萜合成酶的基因，CitMTSE1，CitMTS3，CitMTS61和CitMTS62。这四个基因通过体外功能试验验证分别编码d-柠檬烯合成酶，-萜品烯合成酶，-萜品烯合成酶和-蒎烯合成酶。它们相应的蛋白质构成了单萜合成酶的特性。另外，在柑橘发育的初级阶段mRNA在果皮中表达活跃13。研究还分离得到CitMTSL1和CitMTSL4基因的cDNA全长，它们是编码1,8-桉油素和（E）-罗勒烯的基因。研究显示这两种基因
9、转录积累模式和1,8-桉油素、（E）-罗勒烯表达模式相一致14。在柠檬外果皮腺体中含有大量单萜物质，通过提取发育初期果皮中的mRNA，将其反转录并分离，Joost等7得到四种新的TPS基因家族成员。这些基因编码的酶以牻牛儿基二磷酸为底物合成的产物为两种（+）-柠檬烯，（-）-蒎烯和-萜品烯，这些产物构成了柑橘精油中常见的17种单萜骨架中的10种，它占到主要成分的90%以上。研究表明檀香挥发油主要成分为萜烯类化合物，其中檀香醇等倍半萜烯类占挥发油总量的60%-80%，通过克隆技术获得了一个参与檀香挥发油形成的萜类合成酶基因15。Liat等16研究倍半萜瓦伦烯合成的关键基因Cstps1，该基因编码
10、的倍半萜合成酶以法尼基二磷酸为底物催化形成单一的倍半萜产物瓦伦烯。对该基因分离研究发现，Cstps1受到果品发育的严格调控，它只在果实成熟时才转录，伴随着瓦伦烯在果实中积累，同时该过程还受到乙烯的影响。Takuro等17克隆了柚子中非循环倍半萜合成酶（E）-法尼烯合成酶（CJFS）基因。它含有1867个核苷酸，其中1680bp编码序列，编码含560个氨基酸的蛋白质。图一 萜烯类物质合成途径摘自Tholl D. 2006. Terpene synthases and the regulation, diversity and biological roles of terpene metabol
11、ism. Curr Opin Plant Biol. 9: 1-8.2.研究方向及进展情况2.1研究方向本课题为“柑橘发育阶段萜烯类成分的合成及其相关基因调控的研究”。主要研究柑橘香气物质，特别是萜烯类物质释放的规律，检测和鉴定香气成分，克隆TPS基因家族成员并研究其表达模式，揭示在柑橘果实发育过程中萜烯类合成较为关键的TPS家族成员，为提高果实的风味品质提供一定的理论基础。2.2进展情况1.对发育过程中不同阶段的脐橙进行采样，共5个采样点，所取样品放置-80保存；2.对5个发育阶段的脐橙果实进行了电子鼻检测分析，结果显示电子鼻能够对样品进行有效区分，并体现出一定的趋势；3.从桃基因组获取15
12、条TPS基因序列，通过BLAST等生物信息学技术，对所得序列进行分析和聚类，初步确定关键基因。3.存在问题1.电子鼻检测结果的组内差异过大，可能需要加大实验的重复数；2.从基因组数据库获得的部分序列没有3UTR区，需要通过克隆和RACE技术来获得3UTR区，进而设计Q-PCR引物以及检测基因表达模式。4.参考依据1 陈芳,阚健全等.浅谈食品风味化学J.中国调味品, 2001(7):30-32.2 魏长宾,刘胜辉等.果实香气成分及其形成研究进展J.热带农业科学, 2009,29(3):59-62. 3 刘涛,谢功昀.柑橘类精油的提取及应用现状J.中国食品添加剂, 2009,1:71.4 孙晓萍,
13、吉永知代等.花椒中萜烯类化合物的GC/MS分析J.中国调味品, 2007,(5):61-63. 5 李瑞红.姜花萜类合成酶基因的克隆与功能研究. 2008.6 柴倩.橘皮精油提取、成分分析及其贮藏加工过程中的品质变化研究. 2007.7 Joost L, Mazen K, Wilfried S, Francel W, Linus H, Harro J, Harrie A. Monoterpene biosynthesis in lemon(Citrus limon) cDNA isolation and functional analysis of four monoterpene synth
14、ases. Eur. J. Biochem, 2002, 269: 31603171.8 Tholl D.Terpene synthases and the regulation, diversity and biological roles of terpene metabolism. Curr Opin Plant Biol,2006, 9:1.9 张永军,王武刚等.转Bt基因棉花抗虫萜烯类化合物时空动态的HPLC分析J.应用与环境生物学报, 2001,7(1):37.10 Jullada L, Jane E, Nigel D, Nicholas H. Biogenic volatile
15、organic compounds in the Earth system. New phytologist. 2009, 183:27-34.11 梁宝生,Rita Baraldi等.夏季黄连木排放萜烯类化合物浓度日变化及排放速率的研究J. 北京大学学报, 2003,39(4): 517-521.12 Wu S, Schoenbeck MA, Greenhagen BT, Takahashi S, Lee S, Coates RM, Chappell J. Surrogate splicing for functional analysis of sesquiterpene synthase genes. Plant Physiol,2005, 138:1322-1333.13 Takehiko S, Tomoko E, Hiroshi F, Masakazu H, Takanori U, Masayuki K, Mitsuo O. Molecular cloning and functional characterization of four monoterpene synthase genes fro
