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1、层析柱装填及相关常识注：常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化 铝作固定相的吸附柱。由于柱分的经验成分太多，所以下面我就几年来过柱的体 会写些心得，希望能有所帮助。1、柱子可以分为：加压，常压，减压 压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的 塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比 如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。减压柱能够减少硅胶的使用量， 感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时 在柱子外面有水汽凝结），以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须 同时使用水泵抽
2、气（很大的噪音，而且时间长）。以前曾经大量的过减压柱，对 它有比较深厚的感情，但是自从尝试了加压后，就几乎再也没动过减压的念头了。 加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些。 压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼缸供气的就行）。特别是 在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分 离效果。个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。2、关于柱子的尺寸，应该是粗长的最好柱子长了，相应的塔板数就高。柱子粗了，上样后样品的原点就小（反映在 柱子上就是样品层比较薄），这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘 米，而样品就
3、有二厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶剂慢 慢冲了。而如果样品层只有 0.5 厘米，那么各组分就比较容易得到完全分离了。 当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了，不过这些成本相对于产品来 说也许就不算什么了（有些不环保的说，不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪 费）。现在见到的柱子径高比一般在1： 510,书中写硅胶量是样品量的3040 倍，具体的选择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开（是指在所需组分 rf在0.20.4，杂质相差0.1以上），就可以少用硅胶，用小柱子（例如200毫克 的样品，用2cmx20cm的柱子）；如果相差不到0.1,就要加大柱子，我觉得可以 增
4、加柱子的直径，比如用3cm的，也可以减小淋洗剂的极性等等。3、关于无水无氧柱，适用于对氧，水敏感，易分解的产品可以湿柱，也可以干柱。不过在样品之前至少要用溶剂把柱子饱和一次，因 为溶剂和硅胶饱和时放出的热量有可能是产品分解，毕竟要分离的是敏感的东 东，小心不为过。也是因为分离的东西比较敏感，所以接收瓶一定要用可密封的， 遵循 schlenk 操作。至于是加压、常压、减压，随需而定。因为是 schlenk 操作， 所以点板是个问题，如果样品是显色的，恭喜了，不用点板，直接看柱子上的色 带就行了。如果样品无色，只好准备几十个 schlenk 瓶，一瓶一瓶的点，不过几 次之后就知道样品在哪，也就可以
5、省些了。像我以前过一根无水无氧柱，需要六 个 schlenk ，现在只一个就能把所要的全收集到。无水无氧柱中用的比较多的是 用氧化铝作固定相。因为硅胶中有大量的羟基裸露在外，很容易是样品分解，特 别是金属有机化合物和含磷化合物。而氧化铝可以做成碱性、中性和酸性的，选 择余地比较大，但是比硅胶要贵些。听说有个方法，就是用石英做柱子，然后用 HF254 做固定相，这样在柱子外面用紫外灯一照就知道产品在哪里了，没有验证 过。哪位做过可以提出来大家参详参详。4、关于湿法、干法上样湿法省事，一般用淋洗剂溶解样品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但溶 剂越少越好，不然溶剂就成了淋洗剂了。很多样品在上柱前是粘
6、乎乎的，一般没 关系。可是有的上样后在硅胶上又会析出，这一般都是比较大量的样品才会出现， 是因为硅胶对样品的吸附饱和，而样品本身又是比较好的固体才会发生，这就应 该先重结晶，得到大部分的产品后再柱分，如果不能重结晶那就不管它了，直接 过就是了，样品随着淋洗剂流动会溶解的。有些样品溶解性差，能溶解的溶剂又 不能上柱（比如DMF,DMSO等，会随着溶剂一起走，显色是一个很长的脱尾）， 这时就必须用干法上柱了。样品和硅胶的量有一种说法是 1：1，我觉得是越少 越好，但是要保证在旋干后，不能看到明显的固体颗粒（那说明有的样品没有吸 附在硅胶上）。溶剂的选择。当然是最便宜，最安全，最环保的了。所以大多选
7、 用石油醚，乙酸乙酯。文献中有写用正己烷的，太贵了，除非特别需要不要用不 然银子哗哗的，流的比淋洗剂还快，不过因为极性很小，有时还是非它不可。乙 醚也可以用，但是就是容易睡觉，注意保持清醒别让溶剂流干了，那样柱子也就 不爽了。二氯甲烷也有用的，但是要知道，它和硅胶的吸附是一个放热过程，所 以夏天的时候经常会在柱子里产生气泡，天气冷的时候会好一些。甲醇，据说能 溶解部分的硅胶，所以产品如果想过元素分析的话要留神，应该经过后继处理， 比如说重结晶等。其他的溶剂用的相对较少，要依个人的不同需要选择了。由于 某些原因，用到的淋洗剂多是大包装的（便宜嘛），我们这里是用 10升或25升 的塑料桶装的，就要
8、注意这些工业品的纯度是较低的。经常能够从送来的大桶底 部看见有色的杂质，其他的杂质就可想而知了，所以在比较严格的柱分时就要对 溶剂重蒸。当然过原料时就可以免去这一步了，反正下面还有提纯的方法。另外 溶剂在过柱子后最好也回收使用，一方面环保，另一方面也能节省部分经费，缺 点是要消耗一定的人工。这里要注意的是，一般在过柱同时进行的是减压旋蒸， 石油醚和乙酸乙酯的比例由于挥发度的不同会导致极性的变化，一般会使得极性 变大，在梯度淋洗时比较合适，正好极性越来越大了。在过完柱子后，溶剂最后 回收要采用常压，因为在减压旋蒸时会有部分低沸点的杂质一起出来，常压时就 会减少这种现象，如果杂质和你下面要过的样品
9、有反应那就惨了。5、关于操作问题。5.1 装柱。柱子下面的活塞一定不要涂润滑剂，会被淋洗剂带到产品中的，可以采用四 氟节门的。干法和湿法装柱觉得没什么区别，只要能把柱子装实就行。装完的柱 子应该要适度的紧密（太密了淋洗剂走的太慢），一定要均匀（不然样品就会从 一侧斜着下来）。书中写的都是不能见到气泡，我觉得在大多数情况下有些小气 泡没太大的影响，一加压气泡就全下来了。当然如果你装的柱子总是有气泡就说 明需要多练习了。但是柱子更忌讳的是开裂，甭管竖的还是横的，都会影响分离 效果，甚至作废！5.1.1 硅胶的预处理浓盐酸浸泡硅胶 14 小时，然后用蒸馏水洗涤硅胶4 次后，将起进行减压抽 滤，后不断
10、加蒸馏水冲洗。在 1 小时之后，抽滤的水呈中性，但仍然含有氯离子。 经过4小时不断的冲洗才使得抽滤液中基本不含氯离子。晾干一周后，在110C 烘箱中活化2 小时。活化后的硅胶加石油醚浸泡并搅拌均匀。在装柱时，宜使用口径较大的玻璃 漏斗置于 层析柱上部，注入1/2 高的石油醚，打开下部活塞，然后尽量均匀地 将硅胶倾入漏斗，这样可以防止层析柱中形成断层（这一步是实验的关键步骤）。5.1.2 添硅胶装柱子（添硅胶）时，有两种方法：即湿法装柱和干法装柱，二者各有优劣。 不论干法还是湿法，硅胶（固定相）的上表面一定要平整，并且硅胶（固定相） 的高度一般为15cm左右，太短了可能分离效果不好，太长了也会由
11、于扩散或拖 尾导致分离效果不好。湿法装柱是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后，再填入柱子中，然后再加压用淋 洗剂走柱子，本法最大的优点是一般柱子装的比较结实，没有气泡。干法装柱则是直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧，至硅胶界 面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度，最后再用油泵直接抽，这样就会 使得柱子装的很结实。接着是用淋洗剂走柱子，一般淋洗剂是采用 TLC 分析得 到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。通常上面加压，下面再用油泵抽，这样 可以加快速度。干法装柱较方便，但最大的缺陷在于走柱子时，由于溶剂和硅 胶之间的吸附放热（可以用手摸柱子明显感觉到），容易产生气泡，这一点在使 用低沸点的
12、淋洗剂时如乙醚，二氯甲烷更为明显。虽然产生的气泡在加压的情况 下不易察觉，但是，一旦撤去压力，如在上样、加溶剂等操作的时候，气泡就会 释放出来，严重时，整个柱子变花，样品不可能平整地通过，当然也就谈不上分 离了。解决的办法是：第一、硅胶一定要添结实；第二、一定要用较多的溶剂 走柱子，一定要到柱子的下端不再发烫，恢复到室温后再撤去压力。也有介绍在硅胶的最上层填上一小层石英砂，防止添加溶剂的时候，使得样 品层不再整齐。但我的感觉是如果小心上样，添加溶剂，则没有这个必要。PS:干法装硅胶柱经验（带口罩在通风厨进行）一边装一边两边均匀用力拍打，或者装完后用真空泵抽一下。 我们用干法 装柱都是，把硅胶装
13、进去之后，拿洗耳球稍微敲打几下后，拿水泵抽紧，边抽边 用洗耳球敲柱，这样可以把柱子装的非常紧凑，尽量排空空气，这样上洗脱剂的 时候就不会那么容易断开。装柱子下面的活塞一定要打开。 干法装柱子下面的 活塞一定要打开 干法装柱先保证柱子清洗干净，玻璃柱内壁光滑（水洗后不挂 珠），柱底安装了砂漏或者以脱脂棉替代，活塞打开保证空气流通。将经过预先计算、秤量好的硅胶一次性沿漏斗倒入柱内。如果不是预先计算 秤量好硅胶，则在装柱时犹豫不决，容易被柱内暴腾的硅胶粉迷惑，不能确认已 经装到了多高的柱高度。两次甚至三次、多次补加硅胶容易导致装柱断层。一次装柱后，在柱下端左右手同时用胶块等物（柔和又有一定硬度的即可
14、） 敲打柱子。不断敲打，同时观察硅胶上端表面的变化，保证硅胶面平行下降，直 到硅胶面落实不再有气体在硅胶面“冒泡”为止。样品溶液用一定体积硅胶（硅胶粒度可小于装柱硅胶）拌匀后，凉干。均匀 铺盖在柱子上表面（一般2cm左右，也要根据柱高、柱直径来确定），稍微敲打 柱壁使上样硅胶踏实。基本装柱完成了。5.2 上样。用少量的溶剂溶样品加样，加完后将下面的活塞打开，待溶剂层下降至石英 砂面时，再加少量的低极性溶剂，然后再打开活塞，如此两三次，一般石英砂就 基本是白色的了。加入淋洗剂，一开始不要加压，等溶样品的溶剂和样品层有一 段距离（24cm就够了），再加压，这样避免了溶剂（如二氯甲烷等）夹带样品 快
15、速下行。上样也有干法和湿法之分：5.2.1 干法上样就是把待分离的样品用少量溶剂溶解后，在加入少量硅胶，拌匀后再旋去溶 剂。如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层。干法上样较麻烦，但可以保证样品 层很平整。5.2.2 湿法上样就是用少量溶剂（最好就是展开剂，如果展开剂的溶解度不好，则可以用一 极性较大的溶剂，但必须少量）将样品溶解后，再用胶头滴管转移得到的溶液， 沿着层析柱内壁均匀加入。然后用少量 芗 洗涤后，再加入。湿法较方便，熟手 一般采用此法。5.3 淋洗剂的选择。感觉上要使所需点在rf0.20.3左右的比较好。不要认为在板上爬高了分的 比较开，过柱子就用那种极性，如果rf在0.6，即使相差
16、0.2也不容易在柱子上 分开，因为柱子是一个多次爬板的状态，可以通过公式的比较：0.6/0.8 一次的分 离度，肯定不如(0.2/0.3)的三次方或四次方大。5.4 样品的收集。用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。所以如果样品与硅 胶的吸附比较强的话，就不容易流出。这样就会发生，后面的点先出，而前面的 点后出。这时可以采用氧化铝作固定相。 另外，收集的试管大小要以样品量而定，特别是小量样品，如果用大试管，可能 一根就收到了三个样品，wuwu。如果都用小试管那工作量又太大。5.5 最后的处理。柱分后的产品，由于使用了大量的溶剂，其中的杂质也会累积到产品中，所 以如果想送分析，最好用少量的溶剂洗涤一下，因为大部分的杂质是溶在溶剂里 的，一洗基本就没了，必要时进行重结晶。另外，再过柱的时候，有时会出现气泡，一是和使用的溶剂有关，如果是易 挥发的溶剂，如乙醚、二氯甲烷等，在室温稍高的情况下，很容
