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1、大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA的转化一、实验目的和要求 通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源质粒 DNA 转入受体菌细胞的技术。了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。二、实验原理感受态细胞(Compe ten t cells):受体细胞经过一些特殊方法(如：CaCl2,等化学试剂法)的处理后，细胞 膜的通透性发生变化，成为能容许外源 DNA 的载体分子通过的感受态细胞 (competent cell) 。转化(t ransforma tion)：是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手 段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。进入细胞的
2、DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞 出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异 株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。转化的方法：化学的方法:使用化学试剂(如CaCl2)制备的感受态细胞，通过处理将载 体DNA分子导入受体细胞；电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用 将载体DNA分子导入受体细胞。克隆的筛选： 主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯 霉素、四环素、链霉素等；将经过转化后的细胞在选择性抗生素培养基中培养，才能较容易地筛选出转 化体，即带有异源DNA分子的受体细胞。否则，如
3、果将转化后的菌液涂在无选择 性抗生素的培养基平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确认哪一个克隆 含有转化的质粒。三、操作步骤1) 大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法)(1) 从E.coli DH5a菌平板上挑取一单菌落，接种于3ml LB液体培养基 中，37C振荡培养过夜。将该菌悬液以1:1001:50转接于200ml LB液体培养 基中，37C振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔2030min测一次 0D600nm,至0D600nmW0.5时停止培养(约2-3小时)；(2) 每人取1个离心管，转入1 ml培养液，在冰上冷却2-3min，于4C， 5000rpm / min离心5
4、min (从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快 而稳)；(3) 吸干上清培养液，用0.5 ml冰冷的0.1 M CaCl2溶液轻轻悬浮细胞， 冰浴15 min ；(4) 5000rpm / min 离心 5min；(6) 弃去上清液，加入100M冰冷的0.1 M CaCl2溶液，小心悬浮细胞， 冰上放置超过1小时后，即制成了感受态细胞悬液；(7) 制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，也可加入占总体积 15%20%左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于-70C 条件下，可保存半年至一年。2) 细胞转化(1) 取1M质粒DNA加入100M感受态细胞，轻轻混匀，冰
5、上放置30min，(2) 于42C水浴中保温1min，然后迅速冰上冷却2min(3) 立即向上述管中分别加入1ml LB液体培养基，摇匀后于37C振荡培养 约 45-60min ，使受体菌恢复正常生长状态，并使转化体表达抗生素基因产物 (Ampr)(该步骤可以省略)。3) 平板培养(1) 取各样品培养液20ul或50ul，涂布于含Amp抗菌素的LB平板 培养基上，(用玻璃棒涂抹，酒精灯烧过后稍微凉一下再用，不要过烫)。(2) 菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于37C恒温培养箱内培养过 夜(12-16小时)。用 CaCl2 法制备的感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒 DNA 产生5x106-2
6、x107个转化菌落。在实际工作中，每微克有105以上的转化菌落足以满 足一般的克隆实验。五、实验结果实验中使用自制的质粒，结果成 功，观察到如下图中所示的培养结果。 转化成功的质粒DNA呈蓝色。转化效率（1）转化子总数=菌落数X稀释倍数X转化反应原液总体积/涂板菌液体积（2）感受态细胞总数=受体菌对照组菌落数X稀释倍数X菌液总体积/涂板菌液体积（3）转化频率（转化子数/每口 g质粒DNA）=转化子总数/质粒DNA加入 量（口g）（4）感受态细胞转化效率=转化子总数/感受态细胞总数六、实验讨论1. 应设立对照：对照齟和转化齟各种成分加存量編号组SU（徽升1（徽升）锹灘冲液徽升）1制菌对翩1005
7、0II质粒H毗对嗟组50一100III转化实验组5C1002. 应注意涂板用菌液浓度：一般应对菌液进行等比稀释，用不同稀释度菌液进行涂板（每一稀释度涂布二皿)，使生长出来的菌落互相独立、不混淆，便于挑取单菌落。板组别含ApLB培养基受悻菌对照组I10-1质粒D阳对照组II10-1转化实验组III10-1 , 10-2 10-33. 防止杂菌和杂DNA的污染(1) 整个操作过程均应在无菌条件下进行(2) 所用器皿，如离心管、tip头等最好是新的，并经高压灭菌处理；(3) 所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污 染，否则会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来麻烦。
