胸腺嘧啶核苷的原理及配置方法

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1、0HNNHOOH胸腺嘧啶核苷的原理及配置方法胸腺嘧啶核苷的应用：胸腺嘧啶核苷为生化试剂，用于制备生物培养基，例如 HAT 选择性培养基的制备。胸腺嘧啶核苷的原理：在单抗制备中，由于需要进行选择性杀死非目标细胞， 所以使用添加HAT的选择性培养基，其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生 物合成途径“D途径”，即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成 提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基蝶吟 是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”另一条途径是应急途径或补救途径 “S途径”，它是利用次黄嘌吟一鸟嘌吟磷酸核苷转移酶（H

2、GPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK） 催化次黄嘌吟和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因此，在HAT培养液中， 未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基蝶吟阻断，虽“S途径”正 常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身 融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌吟鸟嘌吟磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”且“D途径”又被氨基蝶吟阻断，所以在HAT培 养液中也不能增殖而很快死亡。只有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞， 既具有效应B细胞的“S途径”又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖

3、的特性，因此 能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。通常HAT中，H （次黄嘌吟）的浓度为1X10-4M, A （氨基蝶吟）为4X10-7M, T （胸腺嘧啶）为1.6X10-5M,在HT培养基中，只需要不加氨基蝶吟，其它都同 HAT。HAT 培养基的配制：100XA （氨基喋吟）贮存液：称取1.76mg氨基喋吟溶于90ml超纯水中，滴加1mol/L 的NaOH 0.5ml助溶，待完全溶解后，加1mol/L HCL 0.5ml中和，再补加超纯水到100ml。 0.22um膜过滤除菌，小量分装，-20C保存。100XHT贮存液：称取136.1mg次黄嘌吟和38.8mg胸腺嘧啶核苷，加超纯水到100ml,置 45-50C水浴中使完全溶解，0.22“m膜过滤除菌，小量分装，-20保存，临用前37C水浴 中溶解。HT培养基：82ml基础培养基中加入1ml HT (100X)，1ml SP (100X)，15ml灭能的犊牛血清。HAT培养基：99ml HT培养基加入1ml A (100X)。