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1、引物设计实例分析(GFP融合蛋白引物设计)引物设计基本原则引物长度(primer length)产物长度( product length)序列 Tm 值 ( melting temperature)G+C 含量( composition)引物二聚体及发夹结构( duplex formation and hairpin)阅读框1. 引物的长度一般为15-30bp,常用的是18-27bp,但不能大于38,因为过长会导致其 延伸温度大于74C,即Taq酶的最适温度2. 产物的长度扩增片段长度为 100600 碱基对。3. Tm 值引物的 Tm 值一般控制在 55-60 度， 尽可能保证上下游引物的
2、Tm 值一致，一般不超过 2 度。 如果引物中的 G+C 含量相对偏低，则 可以使引物长度稍长，而保证一定的退火温度。Tm=2( A+T) +4( C+G)4. 引物的 GC 含量有效引物中(G+C)的比例为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC 含量不能相差太大。5. 引物自身引物间3端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败任务用绿色荧光蛋白（GFP）标记蛋白NR1pcDNA3,lpcDNA3.1NR1的编码序列KOOObp)121 ggggc+cc+a gagaacccgg gggcgc+tga ccgcgcgcgg gcggcccgcg ggtcgtaca
3、t 181 cgcgagg+cg tcgcactcgc gcaacccaga gccaggcccg c+gtgcccgg agctca+gag 241 caccatgcac ctgctgacat tcgccctgct tttttcctgc tccttcgcc c gcgcggatcc 301 cgaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gc+gagcacg cgcaagcatg aacagatg+t 361 ccgcgaggca gtaaoccagg ccaataagcg ac-acggctct tggaagat口匚 agctcaacgc 421 cacttctgtc a
4、cccacaagc ccaacgccat acaga+ggcc c+gtcag+gt gtgaggacct 481 ca+ctctagc caggtc+acg c+a+cc+agt tagccacccg cctac+ccca acgaccactt 541 cactcccacc cctgtc+cct acacagctgg ctictacaga atccc+gtcc tgggactgac 601 tacccgaatg tccatc+act ctgacaagag ta+ccacc+g agt+tccttc gcacggtgcc 661 gccctactcc cacc-ag+cca gcg+ctgg+
5、t tgag口tg口均 cgagtctac口 ac+ggaacca 721 catca+cc+g c+ggtcccg acgaccacga gggacgggca gcgcagaagc gettggagac 781 g+tge+ggag goaegggagt ccaaggcag口 gacgtgctg cagt+tgacc caggaaccaaM鱼为:言号肽莹鱼为BamHIW切位也下划线标出酶切位点罚阅读框GFP 序列(TOObp)4TGSTG妬CA妬 G&CGAGGAGC TGTTCACCGG GfiTGTGCCC ATCCTfi&TCfi A&CTS6ACGG C&ACffTAAAC G&CC
6、ACAAffT TCAGCGTGTC CGGCGAGGC GAGGCGATG CCACCTACGG CAASCTS4CC CTSAA6TTCA TCTSCACCAC CS&CAASCT& CCCGTfrCCCT G&CCCACCrr CGT&ACCACC TTCGGCT/ACG (JCCT6CA6T6 CTTC6CCC&C TACCCC6ACC ACAJ6AA6CA &CAC6ACTTC TTCAA6TCCG CCATSCCCGA AS&CTAC&TC CAGGAGCGCA CCATCTTCTT CAAGGACGAC GGCAACTACA AG盘CCC&C&5 C&A&ffTSAAG TTC&
7、A&6C& ACACCCTOST &AACCGC/ATC fr/AGCTCAAGG SCATCGACTT CAAGGAGAC 66CAACATCC T6666CACAA 6CTS6A6TAC AACTACAACA GCCACA/AC6T CTATATCATS GCCGMAAGC AGAAGAACGfi CATCAAGGTG AACTTCAAGA TCCGCCACAA CATCGASGAC CACTeC A6CTC6CCGA CCACTACCA& CA&AACACCC CCATTC&GC&A CGGCCCCGTG CTGCTGCCTXC CAGTCCGCCC CCCCAACtSAd AAdCCS
8、ATC ACATlSSTCCTSCTTfiGAffTTC GT&ACC6CC6 CCS&GATCAC TCTCS&CATG GACGAGCTGT ACAAGTAA引物要求PCR扩增GFPGFP两边添加BamHI酶切位点保证NR1的阅读框不改变第一步：扩增GFP基本序列GFP序列5J ATG&TGAGCAAGGGC&A&A&C TCTC（CAT&ACGAGCT&TACAATAA 3，3P TACCACTC&T1CCCGCTCCVCG .A&AGCCGTACCTGCTC&ACAT&TTCATT 5F变性引物复51 ATG&T&A&CAA&G&C&A&GAGC TCTC&CATACA&CT&yACA
9、A&TAA 卽 A&A6CCGTACCT&CTCACAT&TTCATT 51 PrimerZPrimarl: 5! A T&T&AA&A&A &CPrimer!： 51Primer2： SPrimarl: 5Prinuir: 5/31 TACClC&i 1Ci-CriCCTP ,.P.CG,TACCTGTCfACATGTTCATT 51ATGGTGAGAAGGCGAGGAGCTT4 CTTGTACA GCTCGTTCCATQCCGA GAAT>GA GCAAGG&CGA GGAGCeTTTA UTfOZA HA第二步：GC比值；Tm值Primtrl：岀 AJ&TGA&CAA6&C&A&AP
10、pinvapZ： 55CTTGTCA&CTC&TCC&CC&A&ArPrimerl: 3 ATGfrT占GGA （&C：60%Jm； 64） Primr2： 3 CTTTACA&CTCTCCATSCC &C7%Jr 66）第三步：酶切位点BamHI: ggatccPrimerl: 5?Primer2: 5?ATGGTGAGCAAG&GCGAGGA CTTffTCGCTCGTCCAT&CC （GC：57%.Tm： 66）Primerl: 5s9gotcc/T>GAGCAAGGGCG/&GAPnmer21 5Jgga+ccCTTSTACAGCTCGTCMTGCC第四步：阅读框NR1序atgag
11、caccatgcacctgctg 口 匕口十tcgcxcTgcttTTTTccitgcrtccMxgtx cgc gcg got ccc gotceccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacgcgcaagcartg 口acagartg十IxGgcg口ggca gtaaaccagg cca口十口agcga匚口cggctct tggaag口十au 口gctcaacgcc口匚十tc+gix 口cccacaagc ecaaegceat acagatggec ctgteagtgt gtgaggacetPNmerl: 55ggotcc/AT>GA&CAA6G&C&AGG
12、AIPrimerl: 5:ggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAatgagcaccatgc 口匚019匚十9口匚口卄匸9匸匚0十9匚卄卄卄匚匚十9(:十匚匚11号匚匚cgc gcg gat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggtgc+gagcacg cgcaagcatg aacagatgt+ccgcg口ggca g+aaaccaggccaataagcg acacggctct tggaagatac agc+caacgccacttctgTuccccacaagc ccaacgccat acaga+ggcc ctgtcagtgt g+gaggacctGF
13、P序列5J ATSffT6A&CAA6G6C&AG6A&C TCTCG6CATSGACGAGCTGTACAA&TAA 35插入GFPJS的组合序cgc gcg gat cc ax&tga&caa&bcga&a&c*.TCTC&GCATGGACGA&CTGTACAAG ?ggat ccc gaccccaag atcgtcaaca Tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcaTg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ecaataagcg acd亡ggctct fggaflgatoc aget亡dcicgc：匚口亡十于(汁g十七 acccacaagc cc
14、aacgccat acaga+ggcc c+gtcagtgt gtgaggacet第五步保护序列Primerl: 5 GCGGggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA Primer2: 5 GCGCggatccctCTTGTACAGCTCGTCCATGCC记得当初写本科论文，感到不知道讨论什么问题好。愣是写了一大段 的PCR条件摸索的讨论。后来PCR成为实验最基本的一步了，但 是发现在PCR中还是有许多需要注意的地方。PCR的第一步就是引 物设计了。引物设计需要注意的地方很多，在大多数情况下，我们都 是在知道已知模板序列时进行PCR扩增的。在某些情况比如构建文 库的时候也会在不知
15、道模板序列的情况下进行设计。这个时候随机核 苷酸序列就与模板不是完全匹配。我们通常指的设计引物都是在已知 模板序列的情况下进行。设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。引物 分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标 间取得平衡。设计引用有一些需要注意的基本原理： 引物长度一般引物长度为1830碱基。总的说来，决定引物退火温度(Tm值) 最重要的因素就是引物的长度。有以下公式可以用于粗略计算引物的 退火温度。在引物长度小于20bp时：4(G+C)+2(A+T)-5C在引物长度大于 20bp 时：62.3C+0.41C(%G-C)-500/length-5C另外有许多软件也可以对退火温度进行计算，其计算原理会各有不同，因此有时计算出的数值可能会有少量差距。为了优化PCR反应, 使用确保退火温度不低于54C的最短的引物可获得最好的效率和特 异性。总的说来，每增加一个核苷酸引物特异性提高4倍，这样，大多数应 用的最短引物长度为 18个核苷酸。引物长度的上限并不很重要，主 要与反应效率有关。由于熵的原因，引物越长
