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1、学号姓名专业年级实验时间提交报告时间 实验目的：1. 学会使用PHYLIP, MEGA和MrBayes构建进化树2. 学会分析建树结果，体会各种方法差异实验内容：系统发育（phylogeny）也称系统发展，是与个体发育相对而言的，它是指某一个类群的形成和发展 过程。系统发育学的目的是研究进化关系,系统发育分析就是要推断或者评估这些进化关系。通过系 统发育分析所推断出来的进化关系一般用分枝图表（进化树）来描述，这个进化树就描述了同一谱系 的进化关系，包括了分子进化（基因树）、物种进化以及分子进化和物种进化的综合。多序列比对的 目标是发现多条序列的共性。本次实验旨在使用PHYLIP，MEGA和Mr
2、Bayes构建进化树，并通过分析 构树的结果，了解各方法的差异性。作业：1. List the title of the orthologous nucleotide and protein sequences you found from Practice 1. Build phylogenetic trees with PHYLIP, MEGA and MrBayes respectively. Make a simple comparison the trees you have got, and try to explain the difference.核酸序列使用的是来自 Trif
3、olium repens（白车轴草）硬粒小麦（Triticum durum）Camellia sinensis（山茶）Cicer arietinum （鹰嘴豆）及Glycine max （大豆）dehydrin的编码脱水素（dehydrin）的DNA序列，这些物种将分别以TF, TC，Cam,Cic 及 Gly 表示；首先对于PHYLIP中的关系，通过五种算法的构树结果可以发现其树形的差异不大。尤其是在FM, NJ, UPGMA三种 算法中，五个物种的亲缘关系显示出较强的一致性，这大概是由于这三种方法都是基于距离法（Distance Method） 的基础上；其次若把FM法树形的从上到下的五个
4、位置分别标号（图），可以发现三种树形中只有UPGMA中 的和位置有差别。实际上这种差别来自于UPGMA算法的特点：具有最近缘关系的两物种到父节点的距离相等， 且等于这两物种距离的一半，其次在这个基础上再添加其他物种，而据枝长的等长不难看出，两物种一旦被确定为 “近邻”它们的位置颠倒与否都是等价的（即在例子中表现为Cam和Gly分别在位和位，与其分别在位和同理，在MEGA软件据UPGMA与NJ构建的树形中（如图），树形也无太大差异，Cic最远，Tc与Tf近邻，Gly与 Cam近邻，但比较的差别在于MEGA与PHYLIP软件UPGMA与NJ法得到的树形，这是由于其基于的距离数值的不同，也因为MEG
5、A与PHYLIP对这五条序列采取的比对方法不同，PHYLIP使用的是Clustal法而MEGA用的比对结果来自于 MUSCLE。Iriticum durum cultivar Langdon stress inducible dehydrin Corjyj geneTrifolium repens putative dehydrin(DHNb-P geneblycine max dehydrin COR47-hke (LOG100816984Camellia sinensis dehydrin 1 (DHNl) mRNACicer arietinum dehydrin DHN3-like (L
6、OCI 01504337Glycine max dehydrin COR47-hke (LOC100816984)Camellia sinensis dehvdrin 1 (DHN1) mRNATriticum durum cultivar Langdon stress inducible dehydrin (Cor39) geneTrifohum repens putative dehydrin (DrlNb-P) geneCicer arietinum dehvdrin DHN3-hke (LOC101504337其次，再看MP、ML（以Phylip为例）及Bayes法，此次Baye法得到
7、的结果与MP法较为接近，表现为Gly与Cam 近邻，Tf与Cic近邻，Tc最远，不过MP法中涉及到了有效信息位点的选取的问题，我认为若个别序列长度很短的 话很可能会影响整体五条序列比对的结果，这大概是MP法不大稳定的因素。最后， Bayes 法与 ML 法树形有一定差异的原因大概是由于贝叶斯的方法很依赖于一个合适的进化模型，并建立在 “独立性假设”的基础上：即，贝叶斯定理假设一个属性值对给定类的影响独立于其它属性的值，所以GTR模型是 否适用还有待了解，至于ML法，在分析序列是也同样使用了一个概率模型来评估各种变异。所以可以预见到，若 Bayes法与ML法使用的概率模型不同，其比对结果自然就会
8、有很大的差异。TriticumCicerCicerTriticumTrifoliumTrifoliumphylip ML法构树(核酸jCamelliaCamelliaGlycineGlycinephylip MP法构树核酸)对于对应的五条蛋白质序列也有相似的特点，但值得注意的是，蛋白质序列没有考虑内含子的存在。倘若以蛋白质 dehydrin 本身为分析对象构树自然应使用蛋白质序列，但若构建物种树的话，使用核酸序列应更为准确。(下图为 Phylip 中蛋白序列的 Bayes 法构树结果)2. Run BLASTP with a protein sequences you are interest
9、ed in, choose RefSeq as the database, select more than 20 hits of different identity (at least pick one for max identity around 90%, 80% 40%, pick a dozen for max identity 30-40%),download the sequences and analyze the evolutionary relationship among the sequences with MEGA (with more than 2 methods
10、) and answers the following questions: Is your tree consistent with the standard taxonomies? Do the trees generated from different methods have the same topology ？If not, describe the differences and indicate why you think the two trees differ. Do the trees show evidence of paralogous evolution ？ Wh
11、ich nodes are orthlogous and which are paralogous bifurcations? Do the trees show evidence of horizontal gene transfer?对同源蛋白质家族，首先利用Clustal X进行多重比对，将大片段的缺失插入和一些模糊不清的联配位置从联配结果 中去除，然后利用Neighborjoining方法构建基因树，再用引自展法法(BootStraping)检验基因树的稳健性(1000次 重复) 。若在复杂的系统发育情况下,基因树与物种树会出现不一致。按照目前的分子系统发育学, 这种不一致是由 分子进
12、化事件，基因重复(gene duplication)和基因丢失(gene loss)引起的。在极大简约法(maximal parsimony)原理 下(即这两种进化事件出现次数达到极小) , 可以追踪出多基因家族历史中的进化事件, 且以此构建与物种进化历史 一致的完整基因树(full gene tree),即协调树(reconciled tree)。本次使用MEGA分别通过最大简约法和极大似然法构建据固氮酶氨基酸序列构树，并于NCBI上的标准物种树比较。 首先，可以发现构建的进化树与NCBI上的物种树有很大的差异。如Halothece sp. PCC 7418(在标准物种树与MP 中标注*号)
13、，在物种树中与Cyanothece sp. PCC 7822近邻，然而在MP法树形结构中分距很远。此外，我们可以看 出，虽然在物种树里面的各节点分别代表31个不同的物种，但属名相同的物种往往近邻或成簇，而MP法则不然标准物种树Pelobacter propionicus DSM 2379Thiorhodococcus drewsiifumonas acetnviHsnKlebsiella pneumoniaeGeobacter bemidjiensis BemRhodobacter JtlJ3P.w*.l,Ilw?9hJ!1l*riosSinorhizobiurn fredii HH103Ci
14、ostridiiplostritjium pasteurianumDesulfotomaculum niqrificans Clostridium arbusti Clostridium sp. Maddingley MBC34-26 Sinorhizobium meliloti 1021Desulfotomaculum acetoxidans DSM 771Methanobacterium sp. Maddingley MBC34 -Thermincola potens JRSyntrophobotulus glycolicus DSM 8271 jjnense YU AN-3Methano
15、sarcina barkeri str. Fusaro * Halothece sp. PCC 7418Anabaena variabilis ColeofasciculusVnfDCIostridium sp. Maddingley MBC34-26MP法圄期樹蚩白序列VnfDAnabaena variabilis ATCC 29413VnfDMethanos耳rcina barkeri str. FusaroVnfDEthanoligenens harbinense YUAN-3 +VnfDCIostridium pasteurianumAnfDCIostridium arbustiAnfDRhodobacter sphaeroides KD131AnfDCIostridium kluyveri DSM 555AnfDThiorhodococcus drewsiiAnfDSyntr叩hobotulus glycolicus DSM 8271nifDMetha no thermococcus okinawe nsis IH1NifDllyobacter polytropus DSM 2926NifDDesulfuromonas acetoxidansNifDHalothece sp. PCC 7418*NifDSinorhizobium meliloti 1021Ni
