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1、动物肝脏中DNA的提取和鉴定一、实验目的1. 学习并掌握动物组织总DNA的提取方法及其原理。2. 掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理和方法。3. 学习核酸染色的方法。二、实验原理为了研究DNA分子在生命代谢中的作用，常常需要从不同的生物材料中提取DNA。由于DNA分子在生物体内的分布及浓度不同，要选择适当的材料提取DNA。动植物中小牛胸腺、动物肝脏、脾脏、鱼类精子、植物种子的胚中都含有丰富的DNA。微生物中，谷氨酸菌体含7%10%,面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大肠杆菌9%10%。从各种材料中提取DNA方法不同，分离提取的难易程度也不同。对于低等生物，如从病毒中提取DNA比较容易，多数病毒DN
2、A相对分子量较小，提取时易保持其结构完整性。从细菌及高等动植物中提取DNA难度大些。细菌DNA相对分子质量较大，一般达2X109Da。因此易被机械张力剪短。细菌DNA，除核DNA外，还有质粒DNA等。1. DNA的基本功能生物遗传信息复制的模板和基因转入的模板，是生命遗传繁殖的物质基础，也是个体生命活动的基础；作为DNA分子中的某一区段，有复制、转录和翻译等主要功能称为基因。2. 核酸的结构与功能核酸(nucleicacid)是以核苷酸为基本组成的生物大分子。天然存在的核酸有两类,一类为脱氧核苷酸(deoxyribonucleicacid,DNA)，另一类为核糖核酸(ribonucleicac
3、id,RNA)。DNA存在于细胞核和线粒体中，携带遗传信息。RNA存在于细胞质和细胞核内，参与细胞内DNA遗传信息的表达。3. DNA的存在形式天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞核中提取DNA时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖、RNA及无机离子等，从中分离DNA。DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。DNP在低浓度盐溶液中几乎不溶解，如在0.14mol/L的氯化钠溶液中溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%,随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中溶解度很大，比纯水高2倍。RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小
4、，在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此在提取时常用此方法分离这两种核蛋白。4. 核酸的理化性质RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样纤维状物。除肌甘酸，鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物,一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L,呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中。DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中稳定。5. 细胞的破碎细胞有坚硬的细胞壁，首先要破碎细胞。方法有三种：（1）机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；（2）化学试
5、剂法：用SDS处理细胞；（3）酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞破碎。6. DNA的提取方法（在这里只介绍浓盐法）利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将两者分离，常用的方法是用lmol/L氯化钠提取抽提，得到的DNP粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡，使之乳化，再离心除去蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中，用2倍体积95%乙醇可将DNA钠盐分离出来。也可用0.15MNaCl液反复洗涤细胞破碎液除去RNP，再以lmol/LNaCl提取脱氧核糖蛋白，再按氯仿-异戊醇法除去蛋白。两种方法比较，后种方法使核酸降解可能少一些。以稀盐溶液提取DNA时，加入适量去污
6、剂，如SDS可有助于蛋白质与DNA的分离。在提取过程中为抑制组织中DNase对DNA的降解作用，在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的络合剂。通常用1.5mol/LNaCl，0.015mol/L柠檬酸钠,并称为SSC溶液，提取DNA。7. DNA的琼脂糖凝胶电泳DNA分子在PH值高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向阳极移动。DNA分子在电场中通过琼脂糖凝胶而泳动，除了荷电效应外，还有分子筛效应。由于DNA分子片段的相对分子量不同移动速度也不同,所以可将相对分子质量不同或构象不同的DNA片段分离。0.6%1.4%琼脂糖凝胶适用于3X10611X106相对分子质量的DNA分子或片段的分离，所
7、需DNA样品量为0.51.0ug。琼脂糖凝胶电泳分离后的DNA可用溴化乙啶染色。溴化乙啶分子可插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间，形成一种荧光络合物。在254nm波长紫外光照射下，呈现橙黄色的荧光。用溴化乙锭检测DNA,可检出10-9g以上的DNA浓度。三、材料、试剂与仪器(一) 材料：动物肝脏(二) 试剂(1) 0.14mol/LNaCl0.15mol/LEDTA-Na溶液：(2) 20%SDS溶液：(3) 氯仿一异戊醇(24:1)混合液：(4) 95%乙醇溶液。(5) 80%乙醇溶液。(6) pH8.0TE缓冲液：10mmol/LTrisHCI,lmmol/LEDTA，其中含RNA酶20u
8、g/ml。(7) 电泳缓冲液：Tris-硼酸一EDTA(50XTBE)pH8.0。(8) 加样缓冲液：0.25%溴酚蓝(BPB)40%蔗糖。(9) 溴化乙啶(EB)溶液：10口g/ml。(10) 琼脂糖凝胶：浓度为0.7%。(三) 仪器(1) 稳压稳流电泳仪(2)可调微量移液器(3)水平电泳槽(4)暗箱紫外透射仪等。四、实验步骤1取新鲜动物肝，称取2g,切成小块，加入4ml0.14mol/LNaCl0.15mol/LEDTA溶液，于研钵中研磨至匀浆，4ml清洗转入离心管中，以4000r/min的转速离心10min。2. 在上述沉淀物中加入0.14mol/LNaCl0.15mol/LEDTA溶液
9、，使总体积为4mL，然后在60C下，滴加20%SDS溶液23滴，边加边摇动，再摇动10min，使核酸与蛋白质分离。3. 加固体氯化钠0.4g混匀，使其最终浓度达到l.4mol/L，水浴30min。4. 加等体积的氯仿一异戊醇，混匀，摇动5min以4000r/min的转速离心10min。离心管内的物质分为三层，上层为含DNA的水相层，下层为氯仿一异成醇混合物，中间层为变性蛋白凝胶。5. 吸出上清液，加入2倍体积95%乙醇溶液(预冷)，产生沉淀。6. 再以4000r/min的转速离心溶液lOmin,弃去上清液(沉淀用80%乙醇溶液离心洗涤)。7. 将沉淀置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥后，加入
10、200ulTE缓冲液，使DNA充分溶解，待用。8. 凝胶板的制备：(1) 取琼脂糖0.7g，加1XTBE缓冲溶液100ml,于沸水浴中至熔化，制成0.7%的琼脂糖胶液。(2) 胶床两头贴上防水胶带，形成8mm高的挡墙，压紧胶带，置水平台面上。(3) 插入梳子，梳齿下端离板底0.5lmm。(4) 在胶床上滴加23滴0.5口g/mL的EB溶液。(5) 将60C凝胶不间断倒入胶床，高34mm，避免气泡，摇匀，室温下凝固。(6) 完全凝固后，撕掉胶带，置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，高于胶面12mm,从一头轻轻斜拉出梳子，除去产生的气泡。9. 加样：将样品DNA溶液与加样缓冲液以5：1的体积比混合，用微
11、量移液器加样，每加完一个样品，冲洗三次。加样量1520l(加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部)。10. 电泳：为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm(两电极间的距离)开始时用较高电压(80V),样品一进入胶内则将电压调至5V/cm。当染料前沿移至底边1-2mm时，电泳毕。11. 观察关闭电源，取出胶床，在紫外检测仪下观察凝胶中的DNA(红橙色荧光)。五、实验预期结果与分析观察动物肝脏中DNA的提取电泳图，分析DNA的提取结果和DNA的纯度。参考文献1 萧能庚生物化学实验原理和方法北京：北京大学出版社，2005，370390.2 郭勇现代生化技术广州：华南理工大学出版社，2006,7375.3 董晓燕生物化学实验北京：化学工业出版社，2004,7375.4 刘箭.生物化学实验教程.北京：科学出版社，2007,4750.5 钱国英.生化实验技术与实验教程.杭州：浙江大学出版社，2009，207209.
