膜蛋白的提取与分离资料

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1、膜蛋白的提取与分离膜蛋白的分离一、简介：1细胞质膜资料1895年Qverton从研究细胞透性得出细胞膜由连续的脂类物质组成II。1925年Gorter&Grendel:用脂单分子膜技术测定细胞膜中脂分子的总 面积，提出：细胞膜是由双层脂分子组成。1935年Danielli&Davson：从测定膜的表面张力得出细胞膜的三明治结构模型，即蛋白质一脂-蛋白质。1959年Robertson:用电镜观察生物膜提出单位膜模型”，将膜的分子 结构与超微机构统一起来厚度：2(暗)+3.5(亮)+2 (暗)=7.5细胞质膜的主要功能概括如下：(1)为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境；选择性的物质运输，包括代谢

2、底物的输入与代谢产物的排除，其中 伴随着能量的传递；(3) 提供细胞识别位点，并完成细胞内外信息跨膜传递；(4) 为多种酶提供结合位点，使酶促反应高效而有序地进行；(5) 介导细胞与细胞、细胞与基质之间的连接；质膜参与形成具有不同功能的细胞表面特化结构。2膜蛋白虽动物细胞主要有9种膜脂，而膜蛋白的种类繁多，多数膜蛋白分子数 目较少，但却赋予细胞膜非常重要的生物学功能。根据膜蛋白分离的难易及其与脂分子的结合方式，膜蛋白可分为两大 类型：外在膜蛋白、内在膜蛋白。(1)外在膜蛋白为水溶性蛋白，靠离子键或其它较弱的键与膜表面的蛋 白质分子或脂分子结合，因此只要改变溶液的离子强度甚至提高温度 就可以从膜

3、上分离下来，膜结构并不被破坏。内在膜蛋白与膜结合非常紧密，一般讲只有用去垢剂(detergent) 使膜解后才可分离出来。获得大量有生物学活性的质膜蛋白对我们显得非常的重要。附注：使用分级抽提方法获得的“膜蛋白”中只有很少一部分是具备多 跨膜区的整和膜蛋白，膜蛋白，到目前为止，仍然是蛋白组学的一个 瓶颈，不管采用2D技术也好，ICAT乃至proein microarray都 还不能有效解决这一问题。二、蛋白抽提谈及蛋白分离，我们想到：超速离心，盐析法、超滤法、凝胶过滤法、 等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶 解法有时这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化。由于

4、蛋白质种类繁多，不同的蛋白质由于结构和组成的差异，其溶解 度也各不相同根据蛋白质的溶解特性，同时可选择不同的溶剂提取， 分为水溶液提取和有机溶剂提取.但是针对膜蛋白的提取与细胞质蛋白，核蛋白提取不同之处在于它是 嵌在膜中的，水溶性不好，基本方法就是用不同的离心速度去掉胞质 蛋白等，最后用去污剂把蛋白从膜中释放出来。膜蛋白分离纯化的重 要步骤是选择适当的增溶用表面活性剂，一般常用的有胆酸盐，CHAPS（种离子去污剂），Emulgen和Lubrol等表面活性剂。1、分离膜蛋白的方法（原则性）：1）先分离膜，然后提取；如选用冷热交替法、反复冻融法、超声破碎 法、玻璃匀浆法、自溶法和酶处理法使得细胞破

5、碎，然后通过剃度离 心得到含有膜蛋白的粗组分。（例如：michaelll液氮研磨组织，加 入匀浆缓冲液及蛋白酶抑制剂。差速离心。蔗糖密度梯度离心。收集 37%与41%间的成分，即为质膜部分。裂解即可收集膜蛋白）2）用特殊的去污剂选择性的分离。从膜上提取蛋白有许多困难在多 数情况下，都是采用去垢剂将疏水蛋白从其膜结构中溶解下来，然后 将蛋白质稳定去垢剂的选择通常是依据他对所需要蛋白质的提取效 率来确定，但在某些情况下，还要考虑到以后的纯化步骤虽然许多膜 蛋白必须在去垢剂存在的情况下进行纯化，但最终仍可能需要除去去 垢剂这常常会引起蛋白质失活，但如果蛋白质是用于测序的，他将不 是一个问题如果不是用

6、于测序的，可考虑使用能够黏附去垢剂的疏水 珠许多文献和生化试剂供应商的产品目录中，都介绍有许多种不同的 可用来溶解膜蛋白的去垢剂然而，他们并不是普遍适用的在设计膜蛋 白溶解方案时，必须考虑某一去垢剂的特殊性质如triton X-100在 280nm处有吸收，如果某蛋白质的测试与280nm处的吸收有关，就应 避免使用这类去垢剂.将膜制剂与胞质蛋白及细胞核分离后，再进一步从细胞膜制剂中将所 需的膜蛋白增溶下来这种做法的好处是可以用强烈的去垢剂提取细 胞骨架的相关蛋白，而无需考虑胞质蛋白、细胞核成分或染色质成分 的混入使用这种方法所获得的膜蛋白，无论在种类上还是数量上，都 比酸溶解法所得到的蛋白（5

7、000Da）要多一般提取的膜蛋白量往往 只占膜蛋白总量的不足01%，所以充分的膜蛋白的提取，无疑对于研 究膜蛋白的结构和功能都是非常重要的第二种方法简单，可靠，但有 时含有其他蛋白。一般的都是利用4度时所有的蛋白质原则上都溶于 Trito nX114水溶液，在温度超过20度时，此溶液分为水相和去污相； 此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中。利用此性 质可提取膜蛋白。3 ）膜蛋白色谱（Chromatography of Membra ne Protei n,CMP）CMP+ 分 离强疏水性蛋白、多肽混合物的层析系统，一般有去垢剂（如SDS） 溶解膜蛋白后形成SDS-融膜蛋白，并由羟

8、基磷灰石为固定相的柱子分 离纯化。羟基磷灰石柱具有阴离子磷酸基团（P-端），又具有阳离子钙（C-端），与固定相结合主要决定于膜蛋白的大小、SDS结合量有关。 利用原子散射法研究CAMP的分离机制发现，样品与SDS结合后在离 子交换柱上存在SDS分子、带电荷氨基酸与固定相中带电离子间的交 换，从而达到分级分离的目的。层析柱提取 http:/ （参步骤）三、4）顺序抽提法：根据细胞蛋白溶解性的差异，用具有不同溶解能力的 蛋白溶解液进行抽提的方法。用Tris碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋 白；把未溶解的pellet用标准液溶解提取高疏水性蛋白；最后用含复 合表面活性剂的蛋白溶解液，最后可以再次抽提前两

9、次抽提后不能溶 解的膜蛋白。5）ce ntrifugal prote in extracti on.离心的CeliaTris extractionlOrmin vortex, 4C intarvafs sonifrcattoncentfifuge10micj2卫如船 25CrIIIcytosolpelletIUrea/ThEOjrea extraction10min vortex, 40 intervals sonrficationIcentrifuge代minJNOOQ缶 25Crriernbrane fractionpellet原理：高渗的蛋白裂解液让细胞溶涨破裂后，超高速离心评价：尽管分

10、级（胞浆和胞膜）之间有清洗的步骤,但是可溶蛋白组分和 膜蛋白组分之间仍然有不少重复的点该方法相较MOLLOY MP教授在 1998年electrophoresis上发表的分级抽提法减去了第一步（用tris抽提 水溶性蛋白）和最后一步（极难溶蛋白）,在操作上也作了简化，总而言之 是一种不错的方法。（codegreen）6）detergent- based：提取时先裂解液裂胞膜（选用不同的去污试剂是 关键），梯度离心分离细胞器（ER），然后分级抽提方法。例如，去掉细 胞器之后的DEBRIS就是核膜，再裂解得到核膜蛋白。而膜蛋白是裂 胞膜时不溶的部分。总的感受：细胞的量要很充足。之后的定性鉴定常用的

11、方法有双向免 疫扩散、免疫电泳及聚丙稀酰胺凝胶电泳等。纯化蛋白质浓度的定量 测定可用双缩脲法、酚试剂法或紫外光吸收法定量鉴定膜蛋白，方便 迅速。到目前为止，提取膜蛋白仍然是蛋白学的一个瓶颈。2、分离膜蛋白的方法(操作)1) 分离细胞膜蛋白的方法：1冰上刮下细胞后将细胞溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液A中，于室温 与液氮罐中反复冻融2次。2 5000转4度离心，驱除核及未裂解的细胞。3取上清12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液 B中。4 12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液C中提 取后测蛋白浓度,SDS-PAGE电泳，分装后-20度保存备用。buffer

12、A:1mMkcl,5mMNacl,3mMMgcl2,50mMHepes,1mMDTT,0 5ug/ml Leupept in ,20uM pmsf(PH=7.4)bufferB:1mMkcl,5mMNacl,3mMMgcl2,50mMHepes,1mMDTT,0 5ug/ml Leupept in ,20uM pmsf(PH=7.4) 1mM EGTAbuffer C : 0.5ug/ml Leupept in ,20uM pmsf,50mMTris-cl(PH=7.0),2) 分离细胞膜蛋白的方法:1、细胞放在冰上，去除上清，用pH7。4的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层 细胞两次2、加入 1 ml2

13、%Trito nX 溶液冰浴 15mi n3、刮下单层细胞，4度下10 000g 5min离心4、溶液37度水浴10min以分离水相和去污剂相，然后37度下2 000g离心5min5、收集水相留作分析6、用500ul冰冷的buffer C溶解去污剂相沉淀，冰浴2min后加温， 在按步骤6再次离心7、按步骤8再次抽提去污剂相，用buffer C将洗涤后的去污剂相稀释 到初始体积&用等量的buffer A分别稀释水相与去污相，并进行免疫沉淀实验 试剂：1、2%tritonX114:2%TritonX114、50mmol/L Tris HCl （pH7。5）、蛋白酶抑制剂2、缓冲液 A （含0。5m

14、ol/LNaCl 的 RIPA buffer）3、buffer C10mmol/L Tris HCl（pH7.5）150mmol/L NaCl5mmol/L EDTA（PH7 5）3）分离细胞膜蛋白的方法:7M urea 2M thiourea4%chaps2.5%sb3-101000000个细胞，可用此buffer lml。冰浴匀浆。冰上置30分钟。4度高速低温离心30mi n。取上清-2 0保存。4) 分离组织膜蛋白的方法：1、取组织，加入10ml Buffer A于冰上充分匀浆。2、J6-HC离心机800rpm, 4C离心10min后，所得上清液转入超速离 心管。3、100000g, 4

15、C离心1hr。弃去上清，沉淀用适量的Buffer B重悬，冰上孵育2hr后分装至EP管，Eppendorf台式离心机10000rpm, 4C 离心30mi n。4、收集所得上清液即为膜组份。Buffer A: 0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl (PH 7.5)，120mM KCl，1mMEDTA,1mM EDTA, 0.2mM PMSF 1ug/ml Leupept in, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aproti nin。冰上预冷。Buffer B： 20mM HEPES (PH 7.5)，10% 甘油，2% Trit on X-100, 1mMEDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF 1ug/ml Leupept in, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aproti nin。冰上预冷。5) 分离组织膜蛋白的方法：RIPA1XPBS1%NP4O05去氧胆酸钠0.1 %SDS以下用时加入10mg/ml PMSF 异丙醇(终浓度 10ul/ml)Aprotinin (30ul/ml)