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1、 芝麻渣提取物抑菌试验的研究摘要: 通过索氏提取法对芝麻渣脱脂3h，然后回流提取14h，得芝麻渣提取物，旋转蒸发和真空干燥得提取物干物质，以平板穿刺法和纸片扩散法研究提取物对大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌，酵母菌和黑曲霉的抑菌效果。结果表明：大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌，酵母菌和黑曲霉均不受芝麻渣提取物的抑制。关键词：芝麻渣提取物，索氏提取法，纸片扩散法，平板穿刺法，抑菌性Study on antimicrobial activity of sesame dregs extract Abstract: Skimmed 3h by Soxhlet extractor for s
2、esame residue then extracted 14h, had sesame dregs extraction than did rotary evaporation,dried in vacuum and extracted dry matter.I also research antibacterial effect of Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, yeast and Aspergillus niger with the help of flat puncturing method a
3、nd disk diffusion method. The results show that: Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Candida and Aspergillus niger were not affected by the inhibition of sesame dregs extracted extract.Keyords: Soxhlet extractor, disk diffusion method, flat puncturing method, antibacterial ac
4、tivity.芝麻（学名：Sesamum indicum）脂麻科，是胡麻的籽种。芝麻中含有丰富的油及营养物质，其中芝麻油61.7%，芝麻蛋白21.9%，芝麻木聚糖1%，以及丰富的芝麻素（很强的抗菌因子），芝麻油酚，卵磷脂，脂溶性维生素A、D、E等。在当今的研究中，从利用微生物发酵法处理芝麻渣提高粗蛋白，改善口性，从利用芝麻渣提取“抗高血压肽”，到研究芝麻渣抗氧化性能，他们涉及到芝麻渣的药用价值，营养价值以及保健价值。抑菌性是综合利用芝麻渣价值的一部分，然而在这方面的研究相对其他方面而言是非常少的。其中，有人研究表明：芝麻饼粕提取物最低抑菌浓度MIC(体积浓度)分别为:大肠杆菌是0.08,枯草芽
5、孢杆菌是0.06,金黄色葡萄球菌是1.00。各供试菌在芝麻素和甾醇的质量浓度分别达到2010-3g/mL和610-3g/mL时的抑制作用最为明显。这说明了不仅鲜芝麻中含有抗菌蛋白等抗菌因子，在芝麻渣中仍含有非蛋白抗菌因子。由于真实可靠的结果在于具有很好的重现性，加之在这方面的研究较少，为此进一步研究他的抑菌性是必要的，以使其达到检验和更完善的目的。另外，为抑菌实验的基本理论和实验技能进行总结和改善提供经验和数据。1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 原料 黑芝麻渣1.1.2 菌种 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、酵母
6、菌（saccharomycetes）、黑曲霉(Aspergillusniger)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)1.1.3 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基：细菌培养；马铃薯-蔗糖琼脂培养基：真菌培养；1.1.4 试剂 氯仿(AR),Tween-80(CP)1.1.5 仪器 双目显微镜，恒温恒湿培养箱，灭菌锅，分析天平，电热鼓风干燥箱，旋转蒸发仪，粉碎机，脂肪抽提器，500ml、200ml、80ml三角烧瓶，25ml甘油瓶，玻璃珠，封口膜，烧杯，移液枪，培养皿，试管（带棉花塞），镊子，滤纸，剪刀，圆规，直尺，电炉。1.2 实验方法1.2.1 工艺路线 芝麻渣粉碎，干燥装入滤纸筒2
7、5g80正己烷脱脂3h80氯仿回流提取14h旋转蒸发常温真空干燥提取物半固体低温冷冻保存备用1.2.2 芝麻渣提取物的提取 采用索氏抽提法4，称取粉碎的芝麻渣25.00g放入滤纸筒中，将滤纸筒置于索氏提取器中，加入200ml氯仿，冷凝回流14h，提取过程中提取液注意避免强光。提取结束后，终止加热并待其冷却。将混合提取液置于旋转蒸发器中，把提取液旋转蒸发得浓缩液，用吸管转移至小玻璃瓶中，真空干燥12d，得提取物固体，然后冷冻保藏备用。1.2.3 培养基的配制 PDA培养基制备马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g水1000mL，pH自然。马铃薯去皮，切成块煮沸30min，然后在500ml烧杯上
8、用8层纱布过滤，并把土豆泥中的残液挤压至烧杯内，再加糖及琼脂，溶化后补足水至1000mL。121灭菌30min。 牛肉膏蛋白胨培养基制备牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂 1520g，水 1000ml，pH 7.07.2。121灭菌20min。1.2.4 抑菌实验1.2.4.1 圆形滤纸片的制备把滤纸对折两次，在上面用圆规画适当数目直径为1cm的圆，然后用剪刀剪取下来，高温蒸汽灭菌（121下灭菌30min）,烘干后备用。1.2.4.2 供试菌种的复壮与纯化将所有供测试的怀疑有可能退化或污染的菌种从斜面转转接到平板上.细菌置于37培养12h，真菌于28培养24h。从平板上刮取45环的
9、适量的菌苔（菌苔直径12mm）加入到10ml无菌水中，制成菌悬液（估计菌悬液浓度至少为1010个/ml）。通过稀释涂布选择50100个菌落的平板，挑取具有该菌种典型特征的菌落，并镜检观察细胞特征是否唯一。如果符合这些条件，可判断为该菌达到菌种纯水平，挑至斜面培养，保藏备用，否则继续筛选。1.2.4.3 菌悬液的制备取适量已活化的待测菌于装有玻璃珠的无菌水小三角瓶中(霉菌采用玻片法制取孢子悬液),震荡摇匀,于4冰箱保存.细菌采用稀释涂布平板法计数,真菌采用显微镜直接计数法测菌体或孢子个数,从而计算出各菌悬液的浓度.然后,把菌悬液浓度稀释为105106cfu/ml，备用。1.2.4.4 含菌平板的
10、制作在无菌操作下将已融化且冷却到约50的无菌培养基(60恒温水浴锅预恒温)倾入无菌培养皿(操作过程中,使平皿倾斜再往其中倒入培养基,勿过多,15ml左右，以铺满皿底为准)，待培养基凝固后用移液枪注入0.1ml（100ul）菌悬液，然后用无菌玻璃涂棒将菌悬液均匀的涂布（多个方向连续涂布），即制得含菌平板，倒置于37培养箱内，空培养过夜，待用。1.2.4.5 供试样液的制备 取两个25ml甘油瓶，分别标记为5%样液（实验组）和1%吐温水（对照组）并向5%样液瓶内加入适量玻璃珠，高压灭菌。无菌操作，向两个25ml甘油瓶内用无菌的5ml移液管注入5ml无菌1%吐温水。用接种环在酒精灯火焰侧挑去0.25
11、g芝麻渣提取物半固体（不便于使用移液枪，因为枪头是有机塑料，很容易吸附芝麻渣提取物半固体，从而难以将其注入甘油瓶内），加入到5%样液瓶内，震荡，摇匀，使半固体溶解，并将其放入80恒温水浴锅巴士消毒20min。（巴士消毒法虽不能达到灭菌的目的，但可杀死大部分非休眠体状态的微生物，保证培养基至少23天内不受这些微生物的影响，这已经满足了本实验的要求。）1.2.4.6 抑菌圈的测定在无菌条件下，将圆形滤纸片分别放入5%样液瓶和1%吐温水瓶内，浸泡约15min后，取出自然沥干，贴含菌平板上，实验组和对照组每皿各放3片。真菌置于37恒温培养18h，细菌置于28恒温培养12h。采用十字交叉法4，测量抑菌圈
12、的直径并取3个抑菌圈的平均值作为抑菌圈的实验值。2 结果与分析2.1 微生物镜检图10倍镜黑曲霉菌丝体 40倍镜黑曲霉菌丝体 40倍镜黑曲霉孢子 100倍油镜大肠杆菌 40倍酵母菌 100倍金黄色葡萄球菌 40倍枯草芽孢杆菌2.2 细胞计数和菌悬液浓度计算结果 金黄色葡萄球菌 N=36个，B=10倍，V=0.1ml所以C=360.110=3.610cfu/ml 大肠杆菌N=186个，B=10倍，V=0.1ml所以C=1860.110=1.8610cfu/ml 枯草芽孢杆菌N=11个，B=10倍，V=0.1ml所以C=110.110=1.110cfu/ml 酵母菌B=8倍 A1（左上） A2(右
13、上) A3（右下） A4（左下） A5（中间）3 5 6 9 10 19 6 8 4 7 6 8 7 8 11 6 3 6 6 83 8 11 12 12 6 5 11 8 9 7 5 3 5 10 10 6 7 12 65 7 14 10 6 14 5 11 3 2 8 9 8 10 6 8 9 5 8 1012 9 10 18 10 6 5 11 6 3 5 8 8 8 6 5 12 6 7 11所以C=（A1+A2+A3+A4+A5）5108=2.48410cfu/ml 黑曲霉B=1倍 A1（左上） A2(右上) A3（右下） A4（左下） A5（中间）3 1 4 3 4 5 4 5 5
14、 7 6 5 3 3 5 4 7 2 10 81 7 2 3 2 2 7 1 4 3 3 3 5 5 3 0 5 4 3 74 1 4 5 2 4 4 4 3 3 2 3 2 2 1 2 4 2 3 45 4 6 2 2 2 5 4 5 6 4 4 2 4 3 2 3 4 3 3所以C=（A1+A2+A3+A4+A5）5101=1.4910cfu/ml2.3 抑菌圈（左侧为实验组，右侧为对照组） 大肠杆菌 枯草芽孢杆菌 金黄色葡萄球菌 黑曲霉 酵母菌 结果表明，在滤纸片周围没有抑菌圈或抑菌圈很不明显。另外，我们还会发现在黑曲霉和酵母菌的平板上有可疑的模糊的圈，若进一步观察会发现它并不是抑菌圈，有两点事实作为依据：该圈是模糊的并不是透明的在该圈内有该菌的分布。可以认为大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌，酵母菌和黑曲霉不受芝麻渣提取物的抑制，反而还具有促进的作用。3 全面总结、分析与讨论3.1 抑菌实验的一般意
