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1、From WHU SKY 50037 免疫荧光实验 第一天传细胞。事先要准备灭菌的镊子和盖玻片（一般用 70%的酒精浸泡，使用 前用酒精灯灼烧，待冷却再放入细胞培养器皿中）。 细胞接种密度应根据细胞类型、转染试剂而定。例如 293 系列细胞接种就要稀一些，因为用磷酸钙转染法细胞不死， 如果生长过密，细胞形态受影响。所以6孔板的接种密度是 1X105。而用Iipo2000转染HeLa或其它细胞，Iipo2000容易致死细胞，所以传 细胞时密度应该大一些，比如HeLa细胞可以（0.5-1） X105 建议最好用比较大的、铺展比较开的细胞做免疫荧光。第二天转染细胞第三天染色准备实验所需试剂Fixin
2、g Buffer：用1XPBS稀释37%甲醛到终浓度3.7%（也可以用冰冻甲醇固定，但是细胞形态容易发生变化，一些蛋白也不适合用此方法固定）， 4 度保存。Stai ning buffer: BSA 1%， 0.1% Trit on or NP40,， 1XPBS。4 度保存。Trit on or NP40先配置10%浓度，放在4度保存，使用时再稀释。a. 吸出培养基，加入300ul fixing buffer/孔（6孔板），室温放置15-20分 钟（注意要让液体覆盖住所有细胞表面）。动作要快，不用把液体吸得很干净，以免细胞干死。以下操作都要注 意这个问题b. 1XPBS洗4次，每次5分钟。c
3、. 加入 0.5ml staining buffer，室温放置 10 分钟。用 staining buffer 稀释 1 抗，例如 a-Flag 1:100-200, a-HA 1:2000。 例如有3个样品需要加a-Flag,准备300ul稀释的a-Flag。d. 剪一张封口膜，平放在一个 10cm 细菌培养皿中，再放入铝制饭盒的（盒子底部一定要平整）。培养皿周围放置湿纸，以保持环境湿度（注 意纸里的水不能流出来）。在封口膜上标记出样品的顺序。在标记附近 滴上50ul稀释1抗，轻轻地将样品盖玻片细胞面朝下地盖在液滴上。 为了防止液滴干了，可在盖玻片上再少许1抗稀释液，但是不能让盖 玻片和封口
4、膜紧贴。盖上铝饭盒的盖子（细胞培养皿盖子不要盖）。如果样品比较少，可直接在 10cm 细菌培养皿中做，湿纸放在培 养皿里,盖上培养皿盖子。4度放置1小时。e. 在六孔板里放上1XPBS，将盖玻片依次放回到孔里，此时细胞面向上。 用1XPBS洗3次，每次5分钟。洗最后一次的同时准备2抗稀释液。用 staining buffer 稀释荧光二抗， 1： 1000-2000。荧光二抗需要避光， 以下操作要尽量避光。f. 另剪一张封口膜。操作与d同，室温放置1小时。g. 操作与 e 相同。用 1XPBS 洗 4 次，最后加入超纯水。从-20 度冰箱中 取出封片剂，室温放置 10 分钟左右。（如果封片剂中没有 DAPI, 在洗 第一次时的1XPBS中加入DAPI 1： 1000染色，之后就用1XPBS和超纯水清洗。）h. 在载玻片上滴上一滴封片剂，用镊子从一侧夹取出盖玻片，另一侧轻 轻靠在吸水纸上，稍微吸一下盖玻片上的水。再细胞面朝下地将盖玻 片盖在封片剂上，从一侧开始慢慢放下，避免有气泡产生。旁边标记 清楚样品名称、抗体和日期。i. 片子放在避光处，室温干燥一夜后，可以观察或放-80 度保存。特别强调：一定夹取盖玻片要小心，一旦片子滑落，比较难判断哪一 面有细胞。最后盖上饭盒盖
