高效力高选择性的Rho激酶抑制剂的发现

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1、高效力高选择性的Rho激酶抑制剂的发现院系：生命科学学院专业：生物技术学号：0570166 姓名：王晨瑜在Rho GTP酶家族中，Rho关联的含交织螺旋的蛋白激酶（ROCK）是研究得最为 深入的效应子之一。Rho GTP酶家族是Ras GTP酶超家族的一个亚族，它就像一台“分 子装置”，当GDP与之结合时失活，当GTP与之结合时激活，通过这种机制精确调控 各条复杂的信号通路1。当GTP酶处于激活状态时能激活许多下游的效应子，ROCK就 是其中之一。ROCK是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，分子量约为160kDa2，该酶有两个 亚型ROCK-I和ROCK-II3，它们的相似性在氨基酸水平上达65%，

2、在蛋白结构域 上达 924。 ROCK 被激活后所产生的病理生理结果是极其复杂的，该酶在平滑肌的收 缩、神经轴突生长的回缩等生理活动中都起着重要的作用；在许多中枢神经系统紊乱疾 病中也可以观察到ROCK的异常激活。所以，抑制ROCK的活性是治疗由上述系统错 乱所致疾病的有效途径，如青光眼、高血压、阴茎勃起功能障碍、哮喘、动脉粥样硬化、 中风、癌症等。目前见诸文献的 ROCK 抑制剂大都含有异喹啉、吡啶、吲唑等基团，这些化合物要 么在 ROCK 生化分析时效力平平，要么细胞活性较差。最近又有文献报道了一类具有发 展前景的新型ROCK抑制剂（ROCK-1抑制剂），其结构是以氨基咲咱-阿扎苯并咪唑为

3、 骨架。在这一新类中，有些化合物的细胞分析IC50值已经低于100nM。O0No本论文作者的目标是发现一种高效力的ROCK抑制剂（ROCK-II抑制剂），它的生 化分析IC50值要低于10nM，细胞分析IC50值要低于100nM；而且，该抑制剂要有高选择性，亦即其对于其他激酶、非激酶酶和受体的IC50值要高于1“M。作者所在实验室于 2006 年（论文发表于 2008 年）通过高通量筛选的方法发现了一个化合物 1以吡啶- 噻唑为母核的酰胺化合物 5，这是一种基于筛选途径的药物发现方式，所谓高通量筛选 是指一种运用计算机控制的高敏化和专一性筛选模式，它能够对大量化合物的药效进行 微量样品的自动化

4、检测，筛选样品一天可达几十万个，命中率约 0.01，大大加速了新 药的寻找和发现过程（仇缀百：药物设计学（第 2版），高等教育出版社， 2008年，第 17页，下文标页码处均引自本书）。虽然1是一种高效力的ROCK-II抑制剂，且选择性 也较高，但肌球蛋白轻链双磷酸化（ppMLC）测试中其IC50值有相对较大的上调。作为 一种先导化合物，往往存在选择性不够、作用强度较弱、药动学性质不佳或有毒副作用 等问题而不能直接用于临床（第213页），所以，作者对1进行了优化：将其中的噻唑 环用苯环来取代，结果有点出乎意料，ROCK-II IC50值和ppMLC IC50值都升高了（也 就是说，该化合物的效

5、力和选择性都降低了）。作者对此结果的解释是：可能是 2 中的 吡啶-苯环系统破坏了 1 中吡啶-噻唑所形成的最佳几何构型。在中心苯环上接一个含氮 五元杂环也许可以模拟1中的吡啶-噻唑结构，所以作者合成了3，与2相比，吡唑环取 代了吡啶环的位置。通过测定ROCK-II IC50值和ppMLC IC50值发现含有吡唑-苯环骨架的3的效力比1 还要强。在中心芳环上引入取代基可以改善该药物的整体药剂学性质和/或增强它的选择 性。因此，作者合成了 4，这一甲氧基取代的化合物表现出了更高的选择性和更强的细 胞效力。然而，令人遗憾的是，4对于MRCK（与ROCK关系最密切的激酶）的选择性 却下降了。为了弥补

6、这一缺憾，作者合成了 5，引入双甲氨乙氧基团来取代4中的甲氧 基，测试结果显示，无论是用生化分析还是用细胞分析， 5 的效力都是相当强的，对于 所有被测酶类的选择性也是相当高的，更令人可喜的是，该化合物对于ROCK-I的IC50 值高达5612nM,充分显示了它对于ROCK-II的高选择性（ROCK-II IC50=3.22.3nM）。 这样，一类新型的ROCK抑制剂（ROCK-II型抑制剂）就诞生了。需要指出的是，这 五种化合物都是外消旋体，各个对映异构体的性质正在研究中。作者还介绍了 5 的合成路线：以2-氟-4-溴-硝基苯（6）为起始反应物，通过亲核取代反应将双甲氨乙氧基侧链加上去生成硝

7、基苯衍生物（7），还原此中间产物生成芳氨化 合物（8）,再在DIEA存在的条件下将8与DMF和HATU联合试剂反应生成溴化衍生 物（9）,最后在碳酸钾存在的情况下，以PdP（Ph）J4为催化剂进行Suzuki偶合反应生 成 5，同样地， 2、3、4 也是用类似的方法合成。结合五个化合物的合成路线，回顾从1到 5的优化过程，作者始终遵循着先导物优 化的三大原则：一、最小修饰原则从1到 2是用苯环取代了噻唑环，从2到 3是用 吡唑环取代了吡啶环，从3到 4是在苯环上引入了甲氧基，从4到 5是用双甲氨乙氧基 取代了甲氧基，在每一步反应中，产物与反应物的差别都很小，基本骨架保持不变；二、 准确运用与先

8、导物相关的生化知识一一由于ROCK的氨基酸序列已经阐明，所以在设计 抑制剂时可以考虑引入一些能与结合域内的氨基酸残基形成氢键的基团（下文有详细介 绍）；三、经济学评估考察上文介绍的合成路径，前四步反应条件简单、试剂易得、 产率较高，最后一步反应试剂较多，但都比较低廉易得，产率为 35，也相对较高；四、 非手性改造15均是外消旋体，所以不存在是否手性改造的问题（第214215页）。接着，作者评价了 15 的体外药物代谢和体内药物动力学性质：作者选择了四种 人类CYP-450酶（2C9、2D6、3A4和1A2）来进行方案筛选，高通量筛选结果显示1 能够较强地抑制所有这四种酶，用一个未被任何基团取代

9、的苯环来替换 1中的噻唑环后 得到的2和3对CYP的抑制能力显著下降;如果在中心苯环上连接双甲氨乙氧基团（5）， 则其对3A4无抑制性。综上所述，这五个化合物都不具备良好的足以全身应用的体外药 物代谢和体内药物动力学性质。这些抑制剂要么肝微粒体稳定性太差，要么清除率太高， 要么AUC太小，要么C 太小，更遗憾的是，这些化合物的口服生物利用度都很低甚 max至没有。然后，恰如软药设计策略所构想的那样，即根据药物的代谢机制，使设计的药 物在完成治疗作用后，按照预定的代谢途径和可以控制的代谢速率，一步转化失去活性， 断下的碎片无毒或几乎无毒，不在体内产生有害的后续反应，并被迅速排出体外，使期 望活性

10、与毒性分开（第 246 页），这些化合物在对青光眼进行局部用药时正好符合软药 的要求，所以治疗该疾病也是ROCK抑制剂富有前景的发展方向之一。然后，作者从ROCK和5的分子结构角度分析了为 何两者有如此高的结合力和选择性：5的吡唑环通过两个 氢键与ROCK相连一个是在ROCK的第172位氨基 酸甲硫氨酸（Met-172）的NH与吡唑环的N之间，另一 个是在Glu-170的主链C=O与吡唑环的NH之间；在磷酸结合区，5的酰胺C=O与Lys-121的侧链NH也形成氢键；在核糖结合区，5的双甲 氨乙氧基团上的质子化了的叔胺基与Asp-176的羧酸酯侧链形成一个非常重要的氢键， 这个氢键可能就是5的选

11、择性高于其他四个化合物的原因，因为在它们与ROCK结合时 都没有这个氢键。需要特别指出的是，在酶-配体复合物的P环（P-loop）下面有一个“疏 水口袋”，而5的苯并二氧六环-苯环结构正好可以浸入其中这是决定5与ROCK的 高亲和力和高选择性的关键因素。为了验证这一结论，作者还合成了两种不含苯并二氧 六环的5的类似物，结果发现它们的IC50值分别是5的307倍和253倍。作者还用间接体内法考察了 5 对于猪眼小梁 网水性体液外流量的影响：用25“M的5溶液对 去核猪眼持续灌注，结果发现，在 1h 时水性体 液外流量增加了 60，在 25h 内外流量增加了 7080这也是外流量增加的最大值。与

12、Y-27632 （一种目前研究得比较透彻的ROCK抑 制剂）相比， 5 在达到同等效应时的剂量比它低 24倍。如果考虑到5和Y-27632在生化和细胞压方面的广阔应用前景。actinControl Compound 5p-MLC分析时效力的差异，这个“低 24 倍”比我们想象的还要好。究其原因，可能是因为 两种化合物所到达的部位（小梁网、近管区、Schlemm管）不同。这些结果强调了 ROCK 在水性体液外流中的作用之重要，也预示了 5这一类ROCK-II抑制剂在降低青光眼眼内为了验证在间接体内实验中5确实是通过抑制ROCK 来增加水性体液外流量的，作者检测了猪眼小梁网肌球蛋 白轻链（MLC）

13、的磷酸化状态。通过Western印迹法检测 发现，空白组条带色深，而实验组条带色浅，这就说明空 白组样品中含有大量磷酸化了的肌球蛋白轻链，而实验组 中的含量极微，进一步分析发现小梁网中的 Rho 激酶的抑制率高达 90，且两组样品 中的肌动蛋白的含量相等。上述数据证明，以苯并二氧六环-苯环为骨架的这类选择性ROCK抑制剂是小梁网肌球蛋白轻链磷酸化有力的调节因子，其与猪眼水性体液外流量的增加也有密切的关系。总之，作者发现了一类新型的高效力高选择性的ROCK-II抑制剂。这类新型化合物 都具有一个起锚定作用的吡唑环和一条能够与酶形成氢键并增强选择性的侧链。在生化 和细胞分析中5均表现出了很强的效力

14、，两种分析方法得到的IC50值（nM）均是个位 数。药理学研究表明5不仅能够有效增加水性体液的外流量，还能够准确参与靶标调节 降低肌球蛋白轻链的磷酸化水平。对于该骨架化合物的进一步优化（包括5的各个 对映异构体的合成和评价）以及更深入的药理学研究工作也正在作者的实验室内进行。酶是药物的重要作用靶点，例如：降血脂药一一羟甲戊二酰辅酶A还原酶抑制剂一 洛伐他汀；降血压药血管紧张素转化酶抑制剂卡托普利；治疗重症肌无力的 药物胆碱酯酶抑制剂溴新斯的明；利尿药碳酸酐酶抑制剂乙酰唑 胺诸如此类，不胜枚举。当今世界范围内治疗药物的靶点大约有500 个，其中靶点 为细胞膜受体的占45，靶酶28，细胞因子和激素

15、11，离子通道5，核酸2， 核受体 2，其他靶点 7（第 70 页）。与其他靶点相比，酶作为人体内所有生化反应 所必须的蛋白质，其分布之广、含量之丰、作用之关键可能远远超出我们的想象，以此 为药靶所生产的药物的用途必定会十分广泛。目前已有许多酶（尤其是激酶）抑制剂用 于癌症的治疗，除了上文讲到的ROCK抑制剂外，还有如酪氨酸激酶抑制剂Lapatinib 可用于乳腺癌的治疗 6；磷脂酰肌醇-3-激酶抑制剂 LY294002 与顺铂合用可有效杀死人 源胰腺癌细胞 7；蛋白激酶 C 抑制剂 Go6976 与咖啡因合用能在人卵巢癌治疗中发挥作 用 8；等等。酶抑制剂的开发前景广阔，大有可为。论文第一作

16、者所属机构一一Scripps研究院是一所私立的、非营利性研究机构（美国 最大的研究院之一），主要从事生物医学研究，在生物分子的基本结构和设计方面处于 世界领先地位。该研究院强调基础生物学知识在医学和材料科学中的应用，追求通过各 学科的融合与合作来取得基础学科的突破，鼓励研究人员敢于面对新时代的挑战。强调 基础学科研究是这个研究院自成立以来的一贯作风，在当今社会，这种甘于沉寂的心态 是弥足珍贵的，一个研究人员如果无法忍受数年的劳而无获，那么他的成就也将无法经 受住时间的考验，从事基础研究往往收效缓慢，自 1959 年“酶的情人” Arthur Kornberg 获得诺贝尔生理学或医学奖以来，酶的研究进展缓慢，这一生物化学的经典分 支被人冷落了多年，近年来以酶为靶点的药物设计开始引起人们的注意，但有趣的是， 大多数与酶有关的药物的发现的文章不是来自