《兽疫链球菌生产透明质酸的生理学原理和应用复习进程》由会员分享，可在线阅读，更多相关《兽疫链球菌生产透明质酸的生理学原理和应用复习进程（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、研究生课程微生物生理学学习报告题目：兽疫链球菌生产透明质酸的生理学原理和应用姓名：任小虎1透明质酸的研究背景1.1透明质酸的结构与性质透明质酸（Hyaluronicacid，简称HA）是一种线性酸性粘多糖,是糖胺聚糖中结构中最简单的一种，化学名称为糖醛（玻璃）酸，分子式为（Ci4H2oNNaOii）n，分子质量为10200万道尔顿。Rapporf等在上世纪五十年代对HA结构的测定做了大量的工作，他们认为HA是由等摩尔的葡糖醛酸和乙酰氨基葡糖组成的。Brimacombef2对酶降解氨基葡萄甘酸键所得的低聚糖进行结构分析研究，也获得一致结论，即确认HA是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖单体为结
2、构单元3，通过J3-1.4糖苷键反复交替连接而组成的线形多糖结构，其一级和二级结构分别如图1、图25所示：rV:M-乙酰基-4育糖胺d-葡萄糖酸纳图1透明质酸的一级结构图1透明质酸的一级结构图2透明质酸的螺旋型二级结构HA通常溶于水，不溶于醇、酮、乙醚等有机溶剂。水溶液中的HA分子可产生分子内和分子间的相互作用，具有特殊的理化性质，具体表现为：零切变粘度、假塑性、粘弹性、易降解性、可发生交联反应、酯化和成盐反应等特性。其中，商品HA为HA-Na盐形式，即HA-Na（简称SH）,外观为白色纤维状或粉末状固体，具有很强的吸湿性。1.2 透明质酸的研究意义HA及其盐广泛分布于机体的各种组织中，具有特
3、殊的生理功能，具体表现为：保水作用、润滑作用、对细胞的保护作用、对组织和血管生成的作用、对肿瘤的防治作用、对创伤愈合和止血等方面的作用，由于这些生理功能，HA被广泛应用于日化用品、食品保健、美容整形及医药等领域。1.2.1 HA在化妆品级领域的应用HA具有保湿、营养、润肤等作用，广泛用于各种高级化妆品中，与传统的保湿剂相比，HA具有更高的保湿效果，而且没有油腻和阻塞皮肤等缺点。HA于皮肤的表皮和真皮中均分布存在，真皮中的HA含量一般多于表皮。HA在皮肤组织中的作用主要是：具优良的保水功能、维持细胞外的空间、大离子功能、参与角蛋白细胞的变化过程、受体结合作用以及清除自由基等功能。1.2.2 HA
4、在食品保健领域的应用上世纪八十年代末，在日本出现了口服HA美容保健食品。它的基本的理论依据是：HA经口服消化吸收，作为体内HA合成的前体物质，增加HA在皮肤和其它组织中的合成量，从而增加皮肤的保水性能，使之更富有弹性，减少皱纹。在人体内，HA的量减少会引起胶原蛋白的变化，胶原蛋白的变化继而引起皮肤的变化。所以，要防止皮肤过早老化，或者当皮肤已经出现老化现象，通过补充HA的方式可以维持胶原蛋白的功能，即HA可起到延迟皮肤衰老的作用。1.2.3 HA在医药领域的应用HA在医药领域具有广泛的应用，其中，HA在药物中可以作为载体，在临床上的应用主要表现为：HA在眼科中的应用、HA在关节疾病治疗中的应用
5、、HA在外科手术中的应用，以及HA在疾病诊断中的应用等。单纯的HA制剂在临床应用中主要有3种类型：胶体涂布、液体喷雾和薄膜覆盖。可广泛应用眼科、骨科、耳科、风湿性痛疼、关节炎等的治疗，均已经取得了令人满意的成果。临床上通过检测HA的血清含量水平，反映各种疾病的变化。现在HA凝胶已作为必需的填充剂广泛应用于人工晶体植入术、白内障囊外摘除术、角膜移植术以及视网膜剥离术等多项有关眼科手术。另外，HA还可以在干眼症和泪道再通等方面发挥作用。HA还可用于关节的注射治疗，并具备较好的疗效，无副作用，是治愈干性鼓膜小穿孔的良好选择之一。2透明质酸的生产概况透明质酸的生产方式HA目前在工业上生产方式主要有两大
6、类：一是从动物组织中提取，二是利用细菌发酵法。近年来，也出现了实验室人工合成的HA，但合成成本高，技术尚不成熟，目前暂不具备工业生产的条件。2.2.1组织提取法组织提取法制备HA，制备过程包括提取、除杂、沉淀、和分级分离等过程。根据不同的组织，HA提取纯化过程有一定的差别，玻璃体和润滑液HA以溶解形式出现，我国已经成功从羊眼、鸡冠、兔皮等动物材料中分离出HA并应用于眼科及外科、化妆等，以鸡冠为原料提取HA及以动物眼玻璃体为原料制备制备透明质酸技术已经非常成熟。HA在动物组织中的分布较为广泛，几乎所有的动物组织都含有HA，只是含量多少而已。人尿和人血清等中都能分离提取出HA，但考虑到原料来源难易
7、及成本等因素，通常用于组织提取法生产HA的原料主要为鸡冠、动物眼球以及人脐带等，提取方法比较类似，均是利用有机溶剂提取分离HA。2.2.2微生物发酵法生产HA的菌种主要是链球菌，例如马疫链球菌、兽疫链球菌和类马链球菌等。除链球菌外，还有Pasteurellamultocida也可以产生HA6。生物发酵法生产HA较组织提取法具有很多优势，具体为：HA产量不受动物等原料资源限制，且品质可控；HA在发酵液中游离存在，易于分离纯化，易于规模化生产；可通过发酵培养参数条件进行控制，提高HA的分子量；生产成本低。发酵法生产HA的主要工艺过程为摇瓶种子液的培养、种子罐种子液的培养、发酵、下游分离纯化（过滤、
8、醇沉淀、HA-CPC沉淀、脱水干燥等）等过程，最后经旋转式真空干燥获得HA。2.2.3 人工合成法近年，日本京都大学科学家人工合成出了HA。采用人工合成法可大大减少HA的生产成本。人工合成的HA与天然HA品质相近7。人工合成HA的方法为，先使用多糖类聚合物合成“HA氧氮杂环戊烯衍生物”，然后再添加分解酶(羊或牛的精巢性HA酶)，制备出酶和衍生物的复合体，最后清除反应液中的酶，经沉淀、分离和精制可成HA。但目前在国内该技术还没发展起来，现阶段主要还是以发酵法生产HA为主，组织提取法生产为辅。2.1 HA的微生物合成途径经过多年的研究，可以确定HA的合成需经过如图3所示途径。合成HA的两个前体是葡
9、萄糖醛酸和乙酰氨基葡萄糖。葡萄糖激酶将葡萄糖转化成6-P-葡萄糖，其有三条代谢途径：进入戊糖磷酸途径；在磷酸葡萄糖变位酶(EC5.4.2.2)的作用下转化成1-P-葡萄糖；或在磷酸葡糖异构酶的作用下转化成果糖。1-P-葡萄糖在UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(HasC,EC2.7.7.9)的作用下转化成UDP-葡萄糖，UDP-葡萄糖在UDP-葡萄糖脱氢酶(HasB,EC1.1.1.22)的作用下转化成UDP-葡萄糖醛酸。果糖有两条代谢途径：进入糖酵解途径或者在转酰胺酶(EC2.6.1.16)的作用下转化成6-P-氨基葡萄糖，6-P-氨基葡萄糖在转乙酰基酶(EC231.4)的作用下转化成6-P-N-乙酰
10、氨基葡萄糖，其在变构酶(EC5.4.2.3)的作用下转化成1-P-N-乙酰氨基葡萄糖。1-P-N-乙酰氨基葡萄糖在焦磷酸化酶(EC2.7.7.23)的作用下转化成UDP-N-乙酰氨基葡萄糖。UDP-葡萄糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖在HA合成酶(HasA)的作用下合成HA。从图3不难看出，一些用于HA合成的前体如1-P-葡萄糖、UDP-葡萄糖和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖胺同时也用于合成细胞壁(约占细胞干重的20%,w/w)，即HA合成和细胞生长之间存在着对碳源的竞争性关系，这是兽疫链球菌发酵生产HA的一个很重要的代谢特性。同时部分碳源(果糖)进入糖酵解途径(产能途径)，其主要代谢产物为乳酸
11、，乳酸对细胞生长和HA合成有较强的抑制作用，因此如何有效转变细胞的产能途径以降低乳酸对细胞生长和HA合成的抑制作用对于提高整个发酵过程的生产强度和生产效率具有重要的意义。A7P右瓠服胺UDP葡超劈A(jACbASM祝锐髓WAITKADH-H1异构悔IJPUDP葡穂辭酸W*UDP-V.O荀糖图3HA的生物合成途径2.3微生物发酵法生产HA研究中仍存在的问题如上所述，HA的生理功能已被人们所认识，具有的广阔应用前景已逐渐展现在人们眼前。而作为一种商品，HA的质量和成本正成为制约HA广泛应用的一个重要因素。发酵法生产HA的成功是近年来HA生产研究取得的最重大的进展，由于其所具有的优点，已逐渐取代传统
12、的动物组织提取法进行HA生产。但是近年来原材料价格的上涨和相应生产成本的提高对HA的微生物发酵法生产构成了巨大挑战，进而限制了其在医药、化妆品和食品保健领域的广泛应用，因此如何进一步提高微生物发酵法生产HA的产率、产量和生产强度成为了推动HA产业持续发展的关键问题。由于发酵过程的高粘度特性以及生产菌株兽疫链球菌S.zooepidemicus自身的生理代谢特性，使得HA产量和产率的提高受到多方面因素的制约，主要有：兽疫链球菌S.zooepidemicus是一种营养要求苛刻的微生物，需提供许多生长必需物质才能正常生长。核苷酸是菌体合成细胞遗传物质的重要组分，是菌体生长的必要物质，HA两种前体物质尿
13、嘧啶核苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)和尿嘧啶核苷二磷酸-N-乙酰氨基-葡萄糖(UDP-GIcNAc)中均含有尿嘧啶核苷二磷酸(UDP)，UDP循环参与了HA的合成，而S.zooepidemicu环能完全由自身合成核苷酸，所以只有保证充足的核苷酸，细胞才能进行正常的生长代谢，HA才能正常合成。此外，由于多种氨基酸的缺陷，外源氨基酸必须均衡全面，这样细胞才能顺利地生长，各种酶系才能良好发育。在消除细胞和HA合成的限制性因素后，有可能使代谢网络通量按照有利HA合成的最优方式或接近最优方式进行，这就需要对发酵过程中的氨基酸和核苷酸的代谢动力学进行深入研究，找到细胞生长和HA合成的关键氨基酸和核
14、苷酸并进行代谢调控和优化，提高HA的产量、产率和生产强度。(2)细胞生长和HA合成之间存在着对碳源和能量的竞争关系。用于HA合成的一些前体物质同时也用于菌体细胞壁的合成，如HA合成途径中的乙酰氨基葡萄糖、1-P-葡萄糖、UDP-葡萄糖也同时用于微生物细胞壁的合成9。因此在碳源的代谢速率不受到影响的条件下，抑制细胞生长有利于HA的合成。3透明质酸发酵优化研究细胞生长对HA的合成有较大影响，这种影响主要是由细胞生长和HA合成之间存在的对碳源和能量的竞争关系引起的。因此，若能够降低细胞生长和HA合成之间对碳源的竞争，提高碳源对HA的转化率，就有可能提高HA产量。降低这种对碳源竞争关系的一种有效途径就
15、是提供给微生物充足生长必需物质(自身合成或外源提供)。S.zooepidemicus是一种营养要求苛刻的微生物，需提供许多生长必需物质才能正常生长。S.zooepidemicus是多种氨基酸缺陷型的生产菌株，必须提供均衡、全面的氨基酸，细胞才能顺利生长，各种酶系才能良好的发育，才有可能使代谢网络通量按照有利HA合成的最优方式或接近最优方式进行。此外，核苷酸是菌体合成细胞遗传物质的重要组分，是菌体生长的必要物质，HA的两种前体物质尿嘧啶核苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)和尿嘧啶核苷二磷酸-N-乙酰氨基-葡萄糖(UDP-GlcNAc)中均含有尿嘧啶核苷二磷酸(UDP)，UDP循环参与了HA的
16、合成，而S.zooepidemicus不能完全由自身合成核苷酸，所以只有保证充足的核苷酸，细胞才能进行正常的生长代谢，HA才能正常合成。3.1 材料与方法3.1.1菌株兽疫链球菌StreptococcuszooepidemicusWSH-24。3.1.2 培养基斜面培养基（g/L）:心脑浸粉（BHI）37，葡萄糖10,酵母粉10,琼脂粉20,pH7.2。种子培养基（g/L）:蔗糖20，酵母粉20,七水硫酸镁2.0,四水硫酸锰0.1,磷酸二氢钾2.0,碳酸钙20,微量元素1mL/L,缓冲液40mL/L,pH72微量元素（g/L）:氯化钙2.0,氯化锌0.046,五水硫酸铜0.019。缓冲液（g/L）:磷酸氢二钠36.76，磷酸二氢钠15.98,碳酸氢钠12.5。发酵
