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1、醋酸纤维薄膜电泳实验技术的探讨电泳是生物化学的基本技术。 电场力、 微粒同支持介质相互作用、热运动扩散、缓冲液流动等对蛋白电泳的运动方向和速度都有影响。多种因素可引起缓冲液流动,电流引起的缓冲液流动称为电渗。但通常电场力决定蛋白质电泳行为 ,缓冲液流动对蛋白质电泳行为的影响太小而难观察到。 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳广泛用于临床检验和电泳的实验教学。 正常条件下血清蛋白点样线靠近阴极端。 实验过程中 , 许多实验者因不清楚点样方式、点样位置等,从而引起实验效果不够明显。本文设计一系列试验,对试验结果进行对比分析,并验证其原因,以期提高学生实验的成功率及电泳效果。一、验器材及试剂1 .器材DYY-
2、5型稳压电泳仪(北京六一仪器厂卜DYY-HI38B电泳梢(北京 六一仪器厂)、 醋酸纤维素薄膜、 新鲜鸡血清、 滤纸、 盖玻片、 烧杯、量筒、容量瓶等。2 .试剂巴比妥缓冲液(pH8.6离子强度为0.06mol/L);染色液;漂洗液。二、试验方案及方法1 .试验方案由于本试验过程中细微操作较多,现就试验中容易出现错误操作的步骤,设计了6 个平行实验:(1)对照:正确操作;(2)倾斜点样;(3)在光滑面点样;(4)正确点样、搭桥时光滑面向下;(5)将浸润的薄膜吸干再点样;(6)正确点样、倾斜搭桥。2 .试验方法(1) 制作血清用加有抗凝剂的一次性注射器抽取适量鸡血液,离心 ,得到新鲜鸡血清,放入
3、4 冰箱保存待用。(2)滤纸桥的制做根据电泳梢膜支架的宽度，剪裁尺寸合适的滤纸条。在两个电极 梢中各倒入适量体积的缓冲液，在电泳梢的两个膜支架上，各放一层滤 纸条,使滤纸一端的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电极缓冲液中。 当滤纸条全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压膜支架上的滤纸以驱赶气泡 ， 使滤纸的一端紧贴在膜支架上。(3)醋酸纤维薄膜的润湿与选择用镣子取一膜条 在据一端1.5cm处画一条直线。之后，小心地平 放在盛有缓冲液的培养皿中。若漂浮于液面的膜条在1530秒内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜条均匀，即可用于电泳；若膜条 润湿缓慢，色泽深浅不一或有条纹及斑点，则表示薄膜厚薄不均匀应弃
4、去，以免影响电泳结果。将选好的膜条用镣子轻压，使其完全浸泡于缓冲液中约510min后方可用于电泳。点样用镣子取出浸透的薄膜，夹在两层滤纸间以吸去多余的缓冲液。 无光泽面向上平放在点样模板上，使其底边与模板底边对齐，在铅笔划 线处点样。点样时用盖玻片轻轻地印在点样区内并随即提取，使血清完全渗透于膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线。(5)电泳用镣子将点样的一端平贴在负极电泳梢支架的滤纸桥上，无光泽面朝下，另一端平贴在正极端的支架上。为了使膜条与电场平行，把膜条与电极之间压严，使膜条绷直，中间不下垂。如有很多膜条同时电泳 时膜条间应相距13mm,使之不互相接触，以免相干扰。盖严电泳室， 平衡10mi
5、n后方可通电。先调节粗调旋钮，然后调节细调旋钮。开始 将电流强度调至0.3mA/cm膜宽,10min后调至0.5mA/cm膜宽,60min 后停止电泳。10min。(6)染色电泳完毕，立即取出薄膜，直接浸入染色液中染色5(7)漂洗将膜条从染色液中取出后,移置到漂洗液中漂洗约5 次,至无蛋白区底色脱净为止。取出薄膜放在滤纸上,自然风干。(8)结果观察三、结果与分析下图为相同电泳条件下,按照不同操作方式所获得的电泳图谱:(1)正确操作;(2)倾斜点样;(3)在光滑面点样;(4)正确点样、搭桥时光滑面向下;(5)将浸润的薄膜吸干再点样;(6)正确点样、倾斜搭桥 (图中的4.1 和5.1中1前的数字代
6、表的是第四次和第五次重彳复)。1 .倾斜点样通过几次试验的结果,对比1 号、 2 号薄膜 ,我们发现,倾斜点样得到的谱带与正确操作得到的谱带并无太大差异。试验结果似乎表明 ,倾斜点样对最后获得的电泳谱带并无太大影响 ,这应该是让我们高兴的事情。 可是这一结果却与带电颗粒在电场中的理论移动行为相悖离也就是说同样的带电颗粒在同一电场中的移动速度不一致。 为什么出现这一现象还需要大量实验和进一步分析。2 .在光滑面点样通过试验结果拍摄的图片,对比1 号、 3 号薄膜 ,我们发现 ,3 号薄膜后落下了长长的尾巴,也就是出现了所谓的拖尾现象,所以血清点在光滑面是一个很严重的错误。由于薄膜光滑面为一层薄薄
7、的聚乙烯,使得血清不能完全浸到粗糙面的乙酸纤维素内 ,电泳过程中同种血清蛋白流动也不一致,严重影响了试验结果。3 .光滑面向下搭桥通过 1 号、 4 号的对比,可见光滑面向下搭桥电泳出的条带虽然区分不清晰 ,但仍能模糊分出 5 条带,只是条带之间的间距比正确操作得出的结果小的多。这是因为光滑面向下时,由于聚乙烯薄膜的阻挡作用 ,使通过薄膜的电流减小,血清蛋白流动变慢,从而导致了条带间距变小 ,试验结果也因此变得不理想。4 .浸润的薄膜吸得太干1 号和 5 号对比可以发现,薄膜太干导致条带难以分离,只出现了3 条带。由于薄膜被吸的太干 ,电泳时电流不容易通过薄膜,被吸在薄膜上的血清蛋白也难以在薄
8、膜上流动而难以分离,从而难以出现5 条明显谱带。5.搭桥时倾斜放置带电的蛋白质离子在电场中是沿着电场的方向流动的 ,当薄膜倾斜时 ,理论上会向着薄膜长形的一条边聚集,然后再沿着边向阳极移动。所以 6 号薄膜电泳出的条带应该还是与点样线平行的,只是越靠近阳极条带越窄,和手机的信号显示差不多。试验结果显示,6 号薄膜仍能区分出 5 条谱带 ,除第一条条带有一些倾斜外 ,其余四条还是与点样线平行的。电泳谱带并没有像预期的那样向薄膜的一边聚集。这与倾斜点样一样,与理论有一定的出入,二者倒是都与薄膜的长轴方向一致,具体原因还需进一步的分析和验证。四、讨论用醋酸纤维薄膜作为区带电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、 快 速、分辨能力强、没有吸附现象、便于保存等优点。但是由于操作不当、实验条件等原因,实验结果往往不够理想。此外,我们还发现,倾斜点样、 倾斜搭桥对实验结果影响不明显,但该结果与理论分析相悖。对这一问题还需要进一步实验和探讨。
