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1、word基于银纳米簇荧光猝灭法检测尿酸摘要以DNA为模板的银纳米团簇作为荧光探针，利用荧光“turn off超灵敏检测生物底物尿酸。在这里，我们利用简单易行、无毒无害的方法合成荧光强度高且稳定性好的水溶性C-Ag NCs，其平均粒径约为，且在565nm处有稳定的荧光发射。检测机理为，尿酸在尿酸氧化酶的催化作用下，被溶解在溶液中的氧气所氧化，可产生过氧化氢，利用过氧化氢对C-Ag NCs的猝灭作用，从而间接测定尿酸的含量。实验结果明确，该C-Ag NCs在565nm左右有很强的荧光发射且荧光稳定性好。在最优实验条件下，尿酸浓度在0.05100MX围内时，体系荧光强度与尿酸浓度的对数之间呈现良好的
2、线性关系，其最低检测浓度为50nM。该方法灵敏度高，选择性好，线性X围宽，检测限低，并可被用于复杂环境中尿酸的测定。由此，该方法不但有希望广泛应用于有过氧化氢产生的氧化复原反响底物的检测；而且，由于该纳米传感器稳定的荧光发射与良好的生物相容性，如假如对其进一步修饰，将有助于其在体内体外分析中得到广泛应用。关键字：C-Ag NCs；H2O2检测；尿酸检测；银纳米簇猝灭Poly(cytosine)-templated silver nanoclusters (C-Ag NCs) as a fluorescent probe, were used to present a fluorescence
3、turn-off assay for biological substrates, which were more amenable to ultrasensitive assay of uric acid. Here, by a simple and nontoxic method, the water soluble C-Ag NCs were synthesized with an average size of 2.5nm and a stable emission at 565nm.The sensing mechanism was mainly based on the notio
4、n, that was, the oxidation of uric acid stimulated by uricase and coupled with the formation of H2O2, by which effective fluorescence quenching of C-Ag NCs.Under optimized conditions, detection of uric acid has a linear concentration range of 0.05 to 50M with a detectable minimum concentration of 0.
5、05M. Therefore, C-Ag NCs as fluorescent probe can detect substrates based on H2O2generating redox reaction and is further modified for analytical applications in vivo due to its superior optical properties and good biopatibility.Keywords:C-Ag NCs; Fluorescence quenching; H2O2;Uric acid.尿酸(2,6,8-三羟基嘌
6、呤， UA)和其他的羟基嘌呤是人体内嘌呤代谢的主要最终产物1。尿酸是由黄嘌呤和次黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶催化作用下转换生成的。人体内血清中尿酸的正常水平X围为，尿排泄中约为2mM2。体液中尿酸浓度的变化可能会导致许多疾病和病理障碍包括痛风3、关节炎4、肾脏疾病5、心血管疾病6、神经系统疾病7、高血压、高尿酸血症、Lesch-Nyan综合症等。以子痫前期为例，子痫前期是一种发生在怀孕期间的高血压疾病,是孕产妇死亡的主要原因8。目前全球大约1015%的孕产妇死于子痫前期9。如果子痫前期出现在怀孕的中期或晚期,那么除了早产婴儿将没有其他治疗该疾病的方法。到目前为止,源于子痫前期的两种症状(高血压和尿液中
7、蛋白质含量高)，该疾病的诊断主要是根据血压和尿蛋白测试10。然而, 通常只有在子痫前期晚期的诊断中才使用这些测试。近年来, 为了降低孕产妇和婴儿死亡率，科研人员致力于开展子痫前期早期诊断的新方法11-12。研究证明,尿酸是尿液和血清样本中一种重要的生物标志物，可能是妊娠高血压(子痫前期)早期测试的关键13-15。血清中尿酸浓度约为时明确病人患有轻度或中度的高血压和蛋白尿，尿酸的浓度大于时病人患有重度子痫前期16。因此,尿酸水平是诊断和治疗这些疾病的一个重要的分子标志物，尤其在检验科能够拥有一套简单可靠的方法用于定期检测尿酸是非常必需的。目前，各种技术被应用于生物环境中尿素的检测,包括电化学方法
8、17-20,化学发光法21-24,荧光法25,色谱分析法26-28,等。在这些方法中,化学发光法易受颜色干扰；色谱法操作麻烦、费时耗力；电化学方法因其高灵敏度,低本钱,快速的响应,兼容性小型化,低人力需求,兼容精细加工技术等优点而得到极大的关注。各种电化学方法如聚合物修饰电极29-31,化学修饰电极32-33,酶修饰电极34,和电化学预处理35均可被用来检测UA。然而，监测尿酸的主要障碍是其他电活性成分的干扰,如抗坏血酸(AA),其氧化电势在各种电极上均与尿酸一样。此外,修饰电极经常存在吸附、污染等干扰。因此，建立一种灵敏度高、抗干扰能力强，简单灵便的方法，是尿酸检测的当务之急。为了检测尿酸含
9、量，尿酸传感器得到广泛研究，尤其是在纳米技术领域。贵金属如Au，Ag，Pt纳米簇由于其独特的物理和光学性质常常被用来构建生物传感器。金属纳米簇拥有很多优点，例如合成简单方便，亚纳米尺寸，光稳定性好，大的Stokes位移，荧光发射波长可调和低毒性等。在这些金属纳米簇中，Ag NCs在荧光生物传感器方面的应用最为广泛。至今， DNA，硫醇类，聚合物，多肽类，蛋白质类等多种支撑材料被用来合成银纳米簇。其中，由于DNA单链中的胞嘧啶与银离子之间有强的亲和力，这使其成为合成银纳米簇的优越模板，并得到了大量关注。通过DNA碱基序列、链的长度或链的二级结构的改变，就可得到荧光发射波长从紫外到近红外X围的C-
10、Ag NCs。据文献报道，C-Ag NCs已经广泛用于金属离子的检测，硫醇类分子的检测，DNA/RNA的检测，蛋白质的检测，活细胞外表标记，细胞内染色等。鉴于此，在本文中，我们首次建立以DNA-Ag NCs为荧光探针检测尿酸含量的光学生物传感器。我们利用硼氢化钠为复原剂，以聚C碱基核苷酸连为模板，合成了无毒害，荧光强度强，光稳定性好的水溶性银纳米簇。基于过氧化氢对银纳米簇的猝灭作用，得以简便快速地检测尿酸。此外，该方法灵敏度高，选择性好，检测限低，且在较宽浓度X围内有良好线性，并可用于复杂体系中尿酸的测定。2.2.1 化学试剂与仪器实验中所用到的核苷酸链5-TTAACCCCCCCCCCCCTT
11、AA-3，由宝生物工程中国，某某某某合成。尿酸氧化酶购自百灵威科技某某中国，。尿酸购自西格玛奥德里奇公司中国，某某。硝酸银、双氧水、磷酸氢二钠Na2HPO412H2O、磷酸二氢钠NaH2PO42H2O、尿酸、葡萄糖、甘氨酸、L-组氨酸、抗坏血酸、尿素等试剂均为分析纯，使用前未经过任何处理。测定中使用的是自制的20mM PB缓冲液pH 7.0，20mM NaH2PO4-Na2HPO4。实验用水来自Direct-Pure Plus 超纯水与RO纯水组合型一体机纯水仪，电阻率为1。实验所用缓冲溶液和超纯水均需灭菌处理。 pH调节是依靠pH计PHS-3C来完成。反响温度控制通过微量恒温器HW-8C实现
12、。所有的荧光光谱实验，均在FL-7000荧光光谱仪日立，日本上完成对样品的荧光测量与分析；固定激发波长为490 nm ，在510 nm 至650 nm X围内收集荧光光谱；激发和发射狭缝宽度均为5.0 nm；扫描速度为1200nm/min，响应时间，PMT电压700V。2.2.2 C-Ag NCs的合成本实验中C-Ag NCs的合成方法如下：首先配制100mM的AgNO3储藏液，灭菌后于4避光存放，使用时稀释成所需浓度使用。DNA冻干粉先于8000rpm离心5min，再用20mM PB缓冲液pH 7.0溶解使其浓度为100M。将L 10mM AgNO3溶液和10L 100M单链DNA模板参加至
13、86.4L 20mM PB缓冲液pH 7.0中，充分混匀，在避光条件下冰中孵育30 min。然后迅速参加3L 2mM 新制的NaBH4溶液，剧烈震荡1 min，于暗处在4下 静置5 h 后，即可进展荧光测量。DNA、硼氢化钠、硝酸银的最终浓度分别为10M，60M 和 60M 。2.2.3 过氧化氢的猝灭作用考察将30%的过氧化氢的原液用20mM PB缓冲液稀pH7.0释至3%的过氧化氢作为储藏液置于4避光保存，不同浓度的过氧化氢溶液由该储藏液稀释得到。由于过氧化氢易分解，故需根据情况重新配制过氧化氢溶液。将 50L 不同浓度的过氧化氢溶液参加到50L 上述制备好的C-Ag NCs中，避光条件下
14、于37 温浴30min 后，进展荧光测定。2.2.4 尿酸含量的检测尿酸储藏液是浓度为4mM的水溶液，使用时先稀释成1mM，然后再根据需要稀释成不同浓度的尿酸溶液。尿酸氧化酶10 unit/mg溶解在PB 缓冲液pH7.0中配制成100g/ml 的尿酸氧化酶溶液，置于4避光保存保存备用。将50L不同浓度的尿酸溶液和50L g/ml的尿酸氧化酶溶液混合，在避光条件下37中孵育20min，然后将这100L混合液参加到100L上述制备的银纳米团簇溶液中，于暗处在37下孵育30min，进展荧光测定。2.2.5 复杂环境中尿酸的检测人血液样品是从当地医院所收集到的健康自愿者血液样品。先将血液样品于120
15、00rpm离心10min，并静置2h以上，得到上层血清液。再用超纯水将上述所得血清稀释不同的倍数，稀释后的血清用于后续尿酸的分析测定。其测定条件与实验过程同上。结果与讨论2.3.1C-AgNCs荧光传感器原理图3.1 基于H2O2对C-Ag NCs荧光的猝灭检测尿酸的根本原理示意图基于H2O2对C-Ag NCs荧光的猝灭，我们建立了一种新的检测尿酸含量的荧光分析方法，作用原理如下列图。根据尿酸的检测过程尿酸在尿酸氧化酶的催化作用下，被溶解在溶液中的氧气所氧化，产生过氧化氢；过氧化氢可以有效猝灭银纳米团簇的荧光。由此，过氧化氢作为中介物，我们能够构建一种尿酸生物传感器以实现其定量检测。2.3.2C-AgNCs的表征图以DNA为模板合成的Ag NCs的三维荧光光谱。实验中所用的DNA序列为5-TTAACCCCCCCCCCCCTTAA-3。最大激发波长为488nm，最大发射波长为556nm，荧光强度为1890。图3.2.2 C-Ag NCs的TEM图和粒径分布图通过快速简便的方法，我们合成出高荧光强度的水溶性的C-Ag NCs。我们对合成的C-Ag NCs进展了荧光性质的考察，实验结果如图1所示。结果明确以该DNA分子为模板合成的银纳米簇，其荧光最大激发波长在488nm左右，最大发射波长在566nm左
