《634901SMARTcDNA文库构建实验流程(clontech)》由会员分享，可在线阅读，更多相关《634901SMARTcDNA文库构建实验流程(clontech)（10页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、#/9rIjsm昌-jxL&In1ua*SMARTTMcDNA文库构建试剂盒操作一览(PT3000-2)本操作一览仅为实验流程，对于初用者，请在使用操作一览前仔细阅读SMARTTMcDNA文库构建试剂盒(Cat.No.634901)的说明书。A.第一链cDNA(fscDNA)合成1. 在0.5-ml离心管中混匀以下试剂：13lRNA样本(对照反应，使用1l的对照RNA)1lSMARTIVOligonucleotide1lCDS111/3PCRPrimer如果总体积5时，用水补齐至5。2. 混匀试剂并瞬时离心。3. 72C孵育2min。冰上冷却2min。4. 瞬时短暂离心。5. 向每管反应中加入
2、以下试剂：2.0l5XFirst-StrandBuffer1.0lDTT(20mM)1.0ldNTPMix(10mM)1.0lSMARTScribeMMLVReverseTranscriptase10.0l总体积6. 使用枪轻柔地混匀试剂，并瞬时离心。7. 42C孵育1hr。之后的LDPCR(步骤B)操作需在冰上进行。8. 引物延伸合成ZscDNA分别向反应管中加入1l氢氧化钠，68C孵育30min，然后进行步骤C。ClontechB.LDPCR扩增合成DNA1. 在一个新的0.5-ml离心管中混匀以下试剂：2lFirst-StrandcDNA(fromStepA.7)0lDeionizedH
3、2O10l10XAdvantage2PCRBuffer2l50XdNTPMix2l5PCRPrimer2lCDS111/3PCRPrimer2l50XAdvantage2PolymeraseMix100l总体积2. 使用枪轻柔地混匀试剂，并瞬时离心。3. 如果需要可以向管中加2滴矿物油，盖上管盖，置于预热(95C)的PCR仪器中。UnitedStates/Canada300,6622566AsiaPacific+1.650.919.7300Europe+33.(01.3904j6880Japan+1(0)77543.6116SMARTcDNA文库构建试剂盒实验流程4. 以下程序选择一种进行扩增
4、：#/9GeneAmp48095C1minGeneAmp2400/960095C20secxcycles*:95C15sec68C6minxcycles*:95C5sec68C6min*参考TableI中最优循环数的使用。C.引物延伸扩增dscDNA1. 混匀以下试剂：11l1 l10l2 l2l2lFirst-StrandcDNA(fromStepA.8)DeionizedH2O10XAdvantage2PCRBufferdNTPMix5PCRPrimerCDSIII/3PCRPrimerTABLEI：RELATIONSHIPBETWEENAMOUNTOFRNASTARTINGMATERIA
5、LANDOPTIMALNUMBEROFTHERMALCYCLESTotalRNA(pg)PolyA+RNA(pg)NumberofCyclesLO2+00.5-LQ18-200.5100250.520-220-25-050J250-2522-240.05-0.250.025-0.12524-265. 取5I产物在1.1%琼脂糖/EtBr胶上进行检测，若检测结果与预期不符时，请参考疑难解答指南（说明书的SectionVIII）。6. 然后进入步骤D。2l50XAdvantage2PolymeraseMix100l总体积2. 使用枪轻柔地混匀试剂，并瞬时离心。3. 如果需要可以加2滴矿物油，盖上管
6、盖后置于预热（95C）的PCR仪器中。4. 以下程序选择一种进行扩增：GeneAmp2400/960072C10minGeneAmp48072C10min95C1min95C20sec3 cycles:95C15sec3cycles:95C5sec68C8min68C8min5. 取5I产物在1.1%琼脂糖/EtBr胶上进行检测，如果结果与预期不符,请参考疑难解答指南（说明书的SectionVII）。D.蛋白酶K消化1. 向05-ml无菌管加入50I扩增后的dscDNA（23和2l蛋白酶（20I）/将剩余dscDNA置于20C保存。2. 混匀试剂并瞬时离心。3. 45C孵育20min,瞬时离心
7、。4. 加入50IDeionieQO。5. 再加入100l酚:氯仿:异戊醇，轻柔地连续颠倒12min。6. 14,000rpm离心5min。7. 将最上层液体（上清液）转移到0.5-ml干净的管。8. 加入100I酚:氯仿:异戊醇，轻柔地连续颠倒12min。9. 14,000rpm离心5min。10. 将最上层液体（上清液）转移到0.5-ml干净的管。11. 加入10I3M昔酸钠，1.3I糖原（20/和260室温95%乙醇，立即进行14,000rpm室温离心20min。12. 小心去除上清液。13. 100I80%乙醇清洗。14. 空气干燥（10min）来挥发残留的乙醇。15.加入79IDei
8、onieQO重悬DNA颗粒。E.SfiI酶切1.在0.5-mI离心管中混匀以下试剂：9cDNA(StepD.15)1010XSfiBuffer10SfiIEnzyme1100XBSA100l总体积2.混匀并在50C孵育2hr。3加入2I1%二甲苯腈蓝，混匀。F.CHROMASPINtm-400cDNA分选1. 标记16个1.5-mI离心管，按顺序摆放在管架中。2. 准备CHROMASPIN-400纯化柱：a. 室温放置CHROMASPIN纯化柱1hr。然后颠倒数次混匀胶质。b. 赶走纯化柱中的气泡，使用1000-I移液器轻柔地重悬胶质。去除底盖让液体滴落。c. 将纯化柱放置在环形支架上。d.
9、借助重力将柱中存储液排干（胶质的顶端应该处于柱外表面1.0-mI标记处。）e. 流速1滴/4060sec，每滴体积40I。3. 当存储液排干后，加入700I柱纯化缓冲液并将其排干。4. 向胶质中央加入100IS消化后的cDNA和二甲苯腈蓝混合液（StepE.3above）。5. 当样本被胶质完全吸收后再进行下一步骤。6. 向胶质中央加入100缓冲液清洗纯化柱。7. 排干缓冲液，胶质表面不能有液体残留。当无液体滴落时，再进行下一步骤。8. 将步骤1中离心管放置在纯化柱下方，使标记1的管对准纯化柱下方液体出口处。9. 加入600I缓冲液后立即使用管116分别收集连续的1滴液体(每管35)o10.
10、从16管中各取3I在1.1%agarose/EtBrgel上150V.电泳10min检测分析。将最能代表实验样本cDNA大小范围的头3-4滴所对应管中的样本合并到一管。11. 向管中加入以下试剂：1/10vol.SodiumAcetate(3M;pH4.8)1.3lGlycogen(20mg/ml)2.5vol.95%ethanol(20C)12. 前后轻柔地摇晃管使试剂混匀。13. 20C或干冰/乙醇中放置1hr。14. 14,000rpm室温离心20min。15. 小心吸掉液体。16. 短暂瞬时离心。17. 小心洗掉液体，然后空气干燥10min。18. 加入7IDeionizedH2O重悬
11、DNA颗粒。G.cDNA连接载体1.标记3个0.5-mI离心管，并向管中分别加入表(TableII)中所列试剂。混匀并瞬时离心。TABLEII：LIGATIONSUSINGTHREEDIFFERENTRATIOSOFcDNATOVECTORComponent1stligation(|jl)2ndligation(pl)3rdligation(pl)cDNAfromStepF1SJ0,5to1.5Vector(500ng/pl)1.01.01.010XLigationBuffer0.50.50.5ATP(10mIVl)0.50.50.5T4DNALigase0.50.50.5eionizsdH0
12、2.01.51.0Totalvolume(|j|i5.05.05.02. 16C孵育过夜。3. 分别进行-phage包装。4. 对文库进行滴度测定(SectionH)。3个连接体系可获得12x10e6个单克隆。未扩增的文库在4C可保存2weeks。5. 可选如果文库12x10e6克隆，可将剩余的cDNA进行连接载体。使用表中cDNA和载体比例重复连接反应能够收获最好的结果；也可以根据cDNA的使用量来扩大体系来做连接。再进行包装反应和滴度测定实验。若这时候滴度还是低的话，请参考说明书中SectionVIII的疑难解答指南。6. 为了提高文库的稳定性，首先将步骤G.4中包装反应物合并，然后参照步
13、骤J对文库进行扩增。扩增后的文库4C可放置67months，或在70C(in7%DMSO)可放置1年。H. 测定未扩增文库的滴度I. 从存储培养板板中选取单个宿主菌株，接种到50-mI含15mlLB/maItose/MgSO4液体培养基的实验管。37C震荡(140rpm)孵育过夜。当OD600o=2.0时，5,000rpm离心5min收集菌体。弃上清，用7.5mI10mMMgSO4.重悬菌体。2. 准备90-mmLB/MgSO4固体培养板，37C预热培养板。3. 使用1Xlambdadilutionbuffer(稀释度=1:5-1:20)稀释未扩增细胞裂解物。4. 向过夜培养的200lXL-B
14、lue中加入1l稀释后的噬菌体，37C作用1015min。5. 加入2ml融化的LB/MgSO4顶层琼脂，快速混匀，立即铺于90-mm37C预热的LB琼脂板上。6. 将培养板室温冷却10min，37C倒置培养618hr。7记数菌斑，并计算噬菌体滴度(pfu/ml):pfu/ml=numberofplaqugExdilutionfactorxplofdiluiedphageplatedI.鉴定重组率通过感染合适的宿主菌株(例如，E.coliXL1-Blue)和蓝白斑筛选，可鉴定含有插入片段的噬菌体。参照未扩增文库滴度测定的步骤(Step.H)来进行蓝白斑筛选，步骤中还需增加的实验是：在铺板噬菌体+细菌混合物时，向融化的顶层琼脂中加入IPTG和X-gal。2ml融化的顶层琼脂使用50IIPTG、50lX-gal存储液。为了获得5001,000菌斑/90-mm板，将培养板在37C孵育618hr。白斑和蓝斑的比例可以快速直观的估算重组效率。成功的
