快速石蜡包埋组织切片的制备

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1、快速石蜡包埋组织切片的制备煮沸固定切片法1. 固定：切取大小适宜(厚度2mm )的组织块，尽快置入装有58ml 10%中 性4%甲醛的试管中煮沸1min，然后已入冷水中。2. 脱水(1) 将已经煮沸固定的组织块取出，用刀片将其厚度修切至1.5mm，随即 置入盛有58 ml丙酮的试管中，煮沸2 min，然后将丙酮倾弃。(2) 再向该试管中重新加入58 ml丙酮并煮沸2min。如此重复34次。3. 浸蜡：将已经丙酮脱水的组织块由试管中取出，用吸水纸去除其表面液 体，随即置入7580C熔化的石蜡中，待组织块下沉、不再出现气泡时(约需30s), 即可包埋。4. 包埋、切片和染色。(1) 用热镊子将预制

2、的蜡块表面熔化，埋入已经浸蜡的组织块。(2) 待埋入组织块的蜡块表面凝固后，即用载玻片轻压蜡块表面片刻，使 蜡块表面平整。(3) 将蜡块置入冰水中，使其变硬。(4) 迅速切片，裱片后用吸水纸去除载玻片上的水分。(5) 将载玻片用火焰烘干(勿距火焰太近)。(6) 迅速进行HE染色。5. 注意事项(1) 为了尽量缩短制片时间，必须预先作好有关准备工作，备齐取材用具、 试管、固定液、丙酮、酒精灯、火柴(或其他引火器)、包埋用蜡块、载玻片和 染色试剂等，放在固定部位待用。(2) 全部制片过程一般在2025min内完成。(3) 制片后剩余组织块应作常规石蜡包埋切片染色，进一步诊断。(4) 含脂肪较多的组

3、织，须经多次丙酮处理。(5) 用于组织固定、脱水、透明的试剂和浸蜡用的石蜡应及时过滤、更换。(6) 丙酮、乙醇、二甲苯等为易燃物，进行上述各项流程时，2m距离内不 得存在明火。加温脱水和浸蜡过程必须应用隔水温箱，不得使用干烤箱操作。超声波快速处理仪石蜡切片法(参照有关厂商的说明书操作)。四、冷冻组织切片的制备应用恒冷箱切片机制备切片：是目前最适用方法。恒冷箱切片机种类较多， 应严格按有关厂商的说明书操作。用于切片的标本必须未曾固定。应用开放式冷冻切片机制备切片 1二氧化碳制冷切片(1) 将组织块放在冷冻台上，滴加OCT或羟甲基纤维素液于组织块周围(将 组织块包埋)，使固定在切片机上的切片刀接近

4、组织块表面。(2) 间断开放液态二氧化碳桶的开关，喷冻组织块和切片刀，使组织块冻 结和切片刀制冷。(3) 迅速移动切片刀进行切片：先将组织块修平，然后调节厚度至812 m处进行切片。(4) 用毛笔将切片展开，贴附于载玻片上，稍干后，置于冷冻切片固定液 中固定lmin，随即进行HE染色。也可用毛笔将切片托入水中，再用玻璃弯针将 切片移至染色皿中进行染色。(5) 组织块也可先在4%中性甲醛中煮沸固定lmin，水洗后再行冷冻切片。 2半导体致冷切片(1) 切片刀与持刀器之间要间隔一层云母片或硬纸片。将冷刀致冷器粘在 刀面上。(2) 将组织冷冻台安装在半导体切片机上。(3) 将冷冻台和切片刀致冷器上的

5、导线连接在控制台直流电源上(注意： 正负电极不可接反)。(4) 连接致冷器的冷却水管并开始放水，然后开启电源；冷却水管中的水 流量不宜过大，在使用过程不得断水。(5) 调整冷冻温度调节器，至切片刀和冷冻台呈现霜冻。(6) 将新鲜组织块或已固定的组织放在冷冻台中央，滴加水或OCT,或用水 调成糊状的甲基纤维素于组织块周围(将组织块包埋)。(7) 待组织块冷冻适当后，进行切片。(8) 对于未经固定的新鲜组织，用毛笔将制作满意的切片展平，立即裱贴 于盖玻片或载玻片上，待冷冻的切片刚要融化时，立即将其置于冷冻切片固定液 中固定lmin。对于已经固定的组织块，可用毛笔将制作满意的切片托入水中，再 用玻璃

6、弯针将切片移至染色皿中进行染色。（9）切片完毕后，先关闭电源，再关闭冷却水，待冰霜融化后擦干机器， 加罩。3甲醇致冷切片（按有关厂商的仪器说明书操作）。4氯乙烷致冷切片（1）将新鲜的或已经固定的组织块置于支持器中央，加少许水或OCT。（2）连续喷射氯乙烷于组织块上，待组织块冻结后，改为间歇喷射，使冻 结适度，立即切片。使用氯乙烷时应注意防火、防爆。（3）进行组织切片的裱贴、固定和染色（与上述方法相同）。 注意事项 1制作冷冻切片所需的试剂和设备等应处于随时可供使用状态。2. 切取的组织块大小适宜（厚度2mm）,并尽快置于冷冻组织切片机上制备 切片。3. 调节冷冻程度，试切合适时便迅速切片。冷冻

7、不足无法切片，冷冻过度 切片易碎。4. 冷冻切片固定液（1）乙醚-乙醇液无水乙醚1份95%乙醇 1份（2）乙醇-冰醋酸液95%乙醇 100ml冰醋酸35滴五、脱钙方法骨和其他钙化组织，通常需要脱去钙盐后进行切片。骨组织脱钙前需先行固 定。常规脱钙法：1. 将骨组织锯成薄片（约1 X1X0.3cm）。2. 在AF中或4%中性甲醛中固定612h。3. 将骨片置于5%硝酸（急需时可置于37*温箱）中脱钙，至用针轻刺可 入时为止，约需1224h （小块骨组织脱钙仅需23h）,其间可更新脱钙液23 次。4. 流水冲洗l2h。5. 移入5%甲明矶液，24h。6. 流水冲洗23h。7. 按常规脱水。8. 石

8、蜡包埋。电解脱钙法：将骨片置于装有 8%硝酸和 10%甲酸混合液的电泳槽（有盖的方形玻璃标本 缸或烧杯）内的阳极处，6V直流电源下持续电解30min3h，至用针轻刺可入时 为止。骨髓组织脱钙：可浸泡于苦味酸乙醇饱和液（占85%）、甲醛（占10%）和 冰醋酸（占5%）的混合液中（同时进行固定和脱钙）。注意事项1. 骨片等脱钙组织的厚度适宜。2. 脱钙组织与脱钙液的体积比1:30。3. 脱钙过程中应不时摇动，多次更换脱钙液。4. 脱钙时间不可过长。5. 微波处理可加速脱钙过程。6. 脱钙后的组织必须用流水充分冲洗。7. 用于包埋的石蜡硬度适中（不要过软或过硬）。六、苏木素一伊红（HE）染色HE染色

9、是应用最广泛的组织病理学常规染色技术。染色程序1.石蜡切片HE染色（常规HE染色）（1）二 甲苯 I 510min（2）二 甲苯 II 510min(3) 无水乙醇I 13min(4) 无水乙醇II 13min(5) 95% 乙醇I 13min(6) 95%乙醇II 13min(7) 80%乙醇 1min(8) 蒸馏水 1min(9) 苏木素液染色 510min(10) 流水洗去苏木素液 1min(11) 1%盐酸-乙醇 13s(12) 稍水洗 12s(13) 返蓝(用温水或1%氨水等) 510s(14) 流水冲洗 12min(15) 蒸馏水洗 12min(16) 0.5%伊红液染色 13mi

10、n(17) 蒸馏水稍洗 12s(18) 80%乙醇 12s(19) 95%乙醇 I 23min(20) 95%乙醇II 23min(21) 无水乙醇I 35min(22 )无水乙醇II 35min(23) 石炭酸-二甲苯 35min(24) 二甲苯 I 35min(25) 二甲苯II 35min(26) 二甲苯III 35min(27) 中性树胶封固注：(12 )和(13)项可省去，但(14)的冲水时间需延长至1015min 细胞核显示更清晰)。倉(23 )项可用无水乙醇代替；北方地区可省略。2. 冰冻切片HE染色(1) 冰冻切片固定1030s(2) 稍水洗12s(3) 苏木素液染色(60D

11、3060s(4) 流水洗去苏木素液 510s(5) 1%盐酸-乙醇 13s(6) 稍水洗 12min(7) 返蓝(用温水或1%氨水等) 510s(8) 流水冲洗 1530s(9) 0.5%伊红液染色 12min(10) 蒸馏水稍洗 12min(11) 80%乙醇 12min(12) 95%乙醇 12min(13 )无水乙醇I 12min(14 )无水乙醇II 12min(15) 石炭酸-二甲苯 23min(16) 二甲苯I 23min(17) 二甲苯II 23min(18) 中性树胶封固注：(7)和(8)项可省去，但(9)的冲水时间需延长至1015min (细 胞核显示更清晰)。倉(15 )项

12、可用无水乙醇代替；北方地区可省略。染色结果：细胞核呈蓝色，细胞浆、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈不同程 度的红色。钙盐和细菌可呈蓝色或紫蓝色。染色注意事项1切片染色前，应彻底脱蜡。2用含有升汞液体固定的组织，其切片染色前应先脱去汞盐：(1) 石蜡切片脱蜡至水洗(2) Lugol 液 20min(3) 流水冲洗 5min(4) 95%乙醇 10min（5）水洗 1min（6）5%次亚硫酸钠水溶液 5min（7）流水冲洗 5min（8）显微镜观察除汞满意后，转入HE染色3脱除福尔马林色素（必要时）：（1）石蜡切片脱蜡至水洗（2）l%NaOH（lml）与 80%乙醇（99ml）混合液 10min（3）流

13、水冲洗 5min（4）转入HE染色4. 严格执行HE染色流程，用显微镜控制细胞核的苏木素染色质量。HE染 片应着色鲜艳，红、蓝分明，对比清晰。5. 载玻片自二甲苯中取出后，应立即用洁净、光亮的盖玻片和稠度适宜的 中性树胶湿封载玻片。封盖处内无气泡，外无溢胶。封片时必须进行操作人员和 局部环境的二甲苯污染防护。不应将组织切片烤干或风干后再行封片。6. 必须在载玻片的一端牢贴标签。标签上应印有病理科所在的医院名称。 标签上应清楚显示有关的病理号及其亚号；标签上的病理号应准确无误，无涂改。7. 制片完成后，技术人员应对切片与其相应的病理学检查记录单或取材工 作记录单认真进行核对；确认无误后，将制备好的切片连同相关的活检申请单/ 活检记录单以及取材工作单等一并移交给有关的病理医师；交接双方经核对无误 后，办理移交签字手续。8. 石蜡切片-HE染色的优良率（甲、乙级切片所占的比率）应85%。石蜡 切片-HE染色质量的基本标准列于附表。9. 制片工作一般应在取材后2个工作日内完成（不含进行脱钙、脱脂等需 要特殊处理的标本）。10. 制片过程出现意外情况时，技术室人员应及时向病理医师和科主任报告， 设法予以补救。