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1、Fmoc固相合成法合成黑色素细胞刺激素(MSH)的工艺研究 固相合成;肽类;MSH;芴甲氧羰基 AIM: To study the process and influencing factors of synthesizing the melanocyte stimulating hormone(MSH) peptide by Fmoc solidphase synthesis. METHODS:With Fmoc to protect the amino acid, TBTU/HOBT/DIEA were used as coupling reagents to synthesize the
2、 peptide of MSH. The synthesized peptide was purified by the chromatograph and identified by mass spectrograph. RESULTS: The peptide yield was 63%.The synthesized peptide purity reached to 98.67% after being purified by RPHPLC. The molecular mass of the synthesized peptide was 1663.88 ku by MALDIMS
3、and it was consistent with the theoretic molecular mass of 1664.08ku. CONCLUTION:This method of synthesis is rapid,simple and effective for the peptide MSH, and its fit for the largescale production. solidphase synthesis; peptides; MSH; Fmoc 目的: 研究9芴甲氧羰基(Fmoc)固相合成法合成黑色素细胞刺激素(MSH)工艺的步骤及其影响因素. 方法: 采用F
4、moc保护氨基,以TBTU/HOBT/DIEA为缩合剂合成MSH. 用色谱仪和质谱仪对合成的多肽进行纯化、鉴定.结果: 多肽合成的得率可达63%,经反相高效液相色谱仪(RPHPLC)对合成的多肽进行纯化后可得纯度为98.67%的目标肽. 通过基质辅助激光解吸附电离飞行质谱仪(MALDIMS)检测所合成多肽的分子质量为1663.88 ku,与其理论分子质量1664.08 ku相符. 结论: 该合成法具有快捷、简便、高效地合成多肽MSH的特点,适合大批量生产. 固相合成;肽类;MSH;芴甲氧羰基0引言多肽作为生物体内的重要组成部分之一,在体内各脏器中有许多复杂而特殊的生理活性1. 黑色素细胞刺激素
5、(MSH)是由13个氨基酸组成的一种内源性的神经免疫调节肽,可抑制发热与主要类型的实验性炎症. 固相法作为多肽合成领域的一个重大突破在合成多肽MSH中具有快速、简便、高效等优点2,但需要对不参与反应的氨基加以保护,同时氨基酸的侧链上的活性基团也要给予保护. 保护基的选择既要保证侧链基团不参与反应,又要保证在肽链合成过程中不受破坏,同时还要保证在最后肽链裂解时能被除去3. 国内外经常采用叔甲氧基(Boc)保护氨基,却难以合成对酸不稳定的多肽. 由于本次合成的多肽MSH中含有色氨酸,对酸不稳定. 我们旨在采用9芴甲氧羰基(Fmoc)基团保护氨基以合成MSH.1材料和方法1.1材料RPHPLC型高效
6、液相色谱仪(Beckman公司);基质辅助激光解吸附电离飞行质谱仪(MALDIMS,Hewleftpackar公司);台式离心机(北京仪器六厂);台式冻干机(军事医学科学院四环仪器厂);Fmoc保护的氨基酸(Merck公司);1羟基苯并三氮唑(HOBT),1氧3双二甲胺羰基苯骈三氮唑四氟化硼盐(TBTU ,ABI公司);二异丙基乙胺(DIEA),三氟乙酸(TFA,Sigma公司);乙腈(Fisher公司);NN二甲基甲酰胺(DMF),二氯甲烷(DCM),异丙醇,FmocRink AmideMBHA Resin吉尔生化(上海)有限公司.1.2方法1.2.1树脂的选择根据导入反应基团的不同,可以把
7、树脂分为氯甲基树脂、羧基树脂、氨基树脂或烯肼型树脂等4. 本次Fmoc固相合成的MSH的末端需要酰氨化,故需要选用一种Rink氨基树脂即Rink AmideMBHA Resin,在Rink Amide MBHA Resin中加入缩合剂TBTU/HOBT/DIEA使MSH的Val与树脂之间形成酰胺键,以此来完成氨基酸的固定.1.2.2FmocValOH 与FmocRink AmideMBHA Resin的连接根据合成多肽的序列,将Rink AmideMBHA Resin置于已用DCM浸泡过的反应器中,加入DMF浸泡30 min左右,使其充分膨胀,然后用含200 mL/L哌啶的DMF溶液脱除树脂上
8、的Fmoc基团,再用异丙醇洗涤树脂2次,最后用DMF洗涤树脂3次,当用50 g/L茚三酮检测呈阳性时将FmocValOH, TBTU, HOBT,DIEA及DMF配成的反应液加入到树脂中,室温下反应1.5 h,当用茚三酮检验呈阴性时再用异丙醇、DMF溶液各洗涤2次. 即完成第1个氨基酸与树脂的连接.1.2.3接肽反应选用的接肽反应缩合剂为具有缩合效率高、反应速度快、不易发生消旋化反应的TBTU/ HOBT/DIEA的混合液5,反应时间约为1.5 h,每次反应后取少量树脂用茚三酮法检测,若呈阳性说明反应不完全,继续加入缩合剂,使其充分反应. 若呈阴性说明反应完全,用含200 mL/L哌啶的DMF
9、溶液脱除新接入氨基酸的Fmoc基团以便于下一个氨基酸的羧基反应. 重复此过程至MSH中所有氨基酸全部接入.1.2.4MSH树脂的切割MSH合成完毕后,用N2吹干MSH树脂,将其置于反应器中,加入切割试剂(10 mL TFA,0.5 mL苯甲硫醚,0.25 mL巯基乙醇,0.5 mL水,0.75 g苯酚),室温下磁力搅拌反应3 h左右,使MSH与树脂分离,再经砂芯过滤,将滤液加入冰乙醚中析出多肽,最后经离心分离获得MSH粗品.1.2.5MSH的纯化和质谱鉴定多肽合成过程中的各种副反应、消旋化以及脱保护的过程中由于保护基的残留、肽键的断裂、烷基化等原因会造成产品不纯. 根据目的肽的要求可采用适当的
10、方法进行纯化. 我们选用的是具有快速、高效和较高回收率等特点的RPHPLC进行纯化6,采用MALDIMS鉴定所得产品.2结果2.1氨基保护基团的选择及其脱除绘制Fmoc基团的脱除效果与哌啶的含量及其脱除时间关系曲线,可以看出随着哌啶含量的增加,脱除反应速度在加快,本次合成选用含200mL/L哌啶的DMF溶液反应25 min,脱除率在99%以上,可以很好的脱除Fmoc保护基团(图1).图19芴甲氧羰基的脱除率与哌啶含量及脱除时间的关系(略)2.2MSH粗品的分析图色谱图中峰数较多,利用色谱工作站软件可知,合成的多肽粗品中,主峰物质占68%(图2).PRHPLC色谱条件: 4.6 mm25 cm(c18,反相); 流动相中A液: 1 mL/L三氟乙酸的纯水溶液,B液: 1 mL/L三氟乙酸的乙腈溶液;梯度洗脱方式: 900 mL/L A液+100 mL/L B液在30 min内降为100 mL/L A液+900 mL/L B液, 流速: 1 mL/min; 检测波长: 215 nm.图2MSH粗品的色谱图(略)