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1、Megazyme总淀粉测定试剂盒(K-TSTA 04/2009)简介:酸水解法和酶法被广泛的应用于淀粉含量测定,酸水解法仅仅适用于纯净的淀粉样品, 应用范围有限。酶法的前处理步骤上有各种变化，经过凝胶、液化和糊精化作用,糊精水解 生成葡萄糖，最终以测量的葡萄糖计算淀粉含量。AACC方法76-11特殊之处在于：在高压蒸 汽和碱性环境下淀粉糊化成为凝胶，然后再用淀粉葡糖苷酶将淀粉转化为葡萄糖进行测量 AACC方法76-11会低估某些样品的淀粉含量，包括高多糖玉米淀粉和众多的经过加工的谷 物产品。今天应用的众多的测定方法都使用了联合处理方法，如在样品处理过程中或直接在 淀粉凝胶化后使用耐热a -淀粉
2、酶。对于难凝胶的样品(如高多糖玉米淀粉)使用了氢氧化钠或 二甲基亚砜作为溶剂。为确保膳食纤维中的淀粉能够全部溶解，Englyst和Cummings(1988) 总结的处理方法中使用了去分支酶，支链淀粉酶。为了测量极端样品得到满意结果，兼顾数量和可靠性， Megazyme 提供了一个总淀粉分 析试剂盒，基于使用耐热性淀粉酶和 淀粉葡糖苷酶。这一方法已被 AOAC 和 AACC 采用 (Method 76.13)。最近，耐热淀粉酶可在低pH环境下使用。因此，我们更新了我们的总淀粉测量方法加 入了这种酶。这一改进的最大益处在于可以在同一pH (pH5.0)条件下进行耐热性淀粉酶和 淀粉葡糖苷酶孵育，
3、简化步骤以及减少麦芽酮糖(抗耐热性淀粉酶和淀粉葡糖苷酶水解)的 产生。另一改进是使用己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸脱氢酶/ NADP+在D-葡萄糖处理步骤 (K-TSHK5)。Megazyme总淀粉分析方法可以测量广泛范围内食品，饲料，植物和谷类产品(自 然的或加工的)。对于大多数样品(例如小麦面粉)，淀粉可以在100oC抗耐热性淀粉酶处理步 骤中完全可溶。包含高水平抗性淀粉(例如高多糖含量玉米淀粉)样品，需要先用冷2 M KOH 或 热DMS O进行预溶解。含可溶性淀粉和糊精的样品，无需进行抗耐热性淀粉酶处理。原理:抗耐热性淀粉酶水解淀粉为可溶性分支麦芽糊精和去分支麦芽糊精。a-amylase,
4、 pH 7.0 or 5.0, IOOC(I) Starch + H2 maltodextrins样品中的抗性淀粉可用2M KOH进行预溶解，再用醋酸钠缓冲液进行中和再进行淀粉酶水解。 或者用DMSO在100七进行溶解。KOH then neutralisation + a-amylase(2) Resistant starch + H?。 maltodextrins淀粉葡萄糖苷酶水解麦芽糊精至D-葡萄糖。AMG(3) Maltodextrins D-glucoseD-葡萄糖氧化为D-葡萄糖酸脂，释放出(H2O2)，再用过氧化氢酶催化进行显色反应，产生醌亚 胺染料。(glucose oxida
5、se)(4) DGlucose + O? + 勺。a D-gluconate + 巧。2(5) 2 日22 + P hydroxy be nzoic acid + 4-aminoa ntipyri ne(peroxidase)quinoneimine dye + 4 HqO样品包含高水平的D-葡萄糖和麦芽糊精可以在分析前用80%乙醇进行洗涤。单个样品可在70 分钟内完成测定。 20个样品可在2小时内完成。特异性，灵敏度，线性范围和精确性此试剂盒专用于分析 -葡聚糖(包括淀粉，糖原，植物糖原和非抗性麦芽糊精)。最小可区分的吸收值是0.01吸收值范围。这对应于1.0mg的D-葡萄糖(或0.9mg淀
6、粉)/L在最 大样品体积1 ml。检测极限：2.0mgD-葡萄糖(或1.8mg淀粉)/L，这对应于0.02吸光度区别在最 大体积1ml中。此试剂盒在5-100ugD-葡萄糖范围内呈线性。一个样品溶液的重复测定中，吸收值会有0.005 至0.010的波动。当样品体积为1ml时，这相当于0.05-1ml/L浓度的D-葡萄糖。如果样品在准备过 程中被稀释，结果需要乘以稀释倍数。例如在样品准备时，样品称重，如10g/L，变异范围将在 0.02 至 0.05g/100g。干扰:如果D-葡萄糖的转化在5分钟内完成，不会产生干扰。可以通过加入D-葡萄糖至反应完成后试管 内(例如50ug在0.1ml)以检测干
7、扰。可以看到吸光度显著上升。样品内的干扰物质可以通过加入内标进行分析。可以对这标准进行定量校正。样品操作中的损失 可以通过在起始步骤中加入D-葡萄糖进行校正。试剂盒成分Megazyme 总淀粉含量测定试剂盒提供有足够运行 100 次试验的试剂,并提供有全部的试验 方法:瓶 1:耐热 a -淀粉酶(10mL, 3,000U/mL 在 CERALPHA 试剂中 pH6.5; 40OC 或 1600U/mL 在 CERALPHA试剂中pH5.0; 40。0。稳定性4年,4 C保存。瓶2:淀粉葡糖苷酶(10mL, 3300U/mL在可溶性淀粉)(或200U/mL在p-nitrophenyl B -ma
8、ltoside*， pH4.5, 40C)稳定性4 年,4 C 保存。完整的分析程序可在获得。瓶3: GOPOD试剂缓冲液。磷酸钾缓冲液(0.26M, pH7.4),对羟基苯甲酸(0.22M)，叠氮 化钠(0.4%W/V)稳定性4年,4 C保存。注意：1. 如果GOPOD缓冲液存储在-20七，会形成盐结晶，用双蒸水稀释至1L前必须完成溶解。2. 此溶液含叠氮化钠(0.4%W/V),有毒。瓶4: GOPOD试剂酶。葡萄糖氧化酶( 12,000 U)和过氧化物酶( 650 U)和4-氨基安替比林 (80mg)。冻干粉，稳定性4年,-20OC保存。瓶5:葡萄糖标准溶液(5ml, lmg/mL)在0.
9、2% W/V苯甲酸溶液中。稳定性4年，室温保 存。瓶6:标准的玉米淀粉。淀粉含量见标签。稳定性4年,-209保存。准备试剂溶液溶液1用试剂1 (100mM醋酸钠缓冲液，pH5.0,自备)稀释1.0mL瓶1成分至30mL。 分成小份后冻存。稳定性3 年, -20OC 保存。注意：如果按照AOAC方法996.11 (example b),用试剂4 (50mM MOPS缓冲液,pH7.0) 稀释酶。溶液 2 此酶不用稀释可以直接使用,由于酶溶液具有一定粘稠度,所以必须使用正确的移液 器。 4C 下保存,稳定性3 年。溶液3用蒸馏水稀释瓶3成分(GOPOD试剂缓冲液)至I1L,立即使用。溶液 4 用
10、20ml 溶液 3 溶解瓶 4 成分再倒回溶液 3 瓶子。铝箔纸包裹避光。这就是 葡萄糖测定试剂(GOPOD试剂)稳定性：4 C下保存，3个月；-20 C下保存， 12个月；分装成小份再进行冻存，只能冻融一次。 新鲜配制的试剂呈浅黄色或浅紫色。 4 C 下保存 2-3 个月过程中，逐渐变成深紫 色。用水为空白对照时，此溶液的吸光度0.05。溶液 5&6 同瓶 5&6自备试剂1醋酸钠缓冲液(100mM, pH50) +氯化钙(5mM)5.8ml 冰醋酸(1.05g/mL)加入 900mL 蒸馏水，用 1M(4g/100mL)NaOH 调节 pH 到 5.0，大 约需要30mL。4 C下保存2个月
11、.添加0.74g二水氯化钙完全溶解，定容到1L, 4 C下保存6个月。注意：可通过添加叠氮化钠(0.2g/L)增加此缓冲液的稳定性。室温2年。必须在pH调完 后再加入叠氮化钠。酸化的叠氮化钠会释放出有毒气体。2醋酸钠缓冲液(12M, pH3.8)69.6ml冰醋酸(1.05g/mL)加入800mL蒸馏水，用4M NaOH调节pH到3.8,定容到1L。 室温下保存12个月。3氢氧化钾溶液(2M)加入112.2 g KOH 至900 mL 去离子水，搅拌溶解，定容一升。储存于密闭容器。室温下2 年。4MOPS缓冲液(50mM,pH70)+氯化钙(5mM) +叠氮化钠(0.02%)(仅用于examp
12、le b分析样 品)11.55g MOPS(钠盐,Sigma cat. M-9381)加入 900mL 蒸馏水，用 1M(10%V/V)HCl 调节 pH 到7.0,大约需要17mLo添加二水氯化钙(0.74g)和叠氮化钠(0.2g),完全溶解，然后调整到1L, 4 C下保存6个月。5.醋酸钠缓冲液(200mM,pH45)+叠氮化钠(0.02%)(仅用于example b分析样品) 冰醋酸(11.8mL,1.05g/mL)加入 900mL 蒸馏水，用 1M(4g/100mL)NaOH 调节 pH 到 4.5, 大约需要60mL。加入叠氮化钠（0.2g），完全溶解，然后调整到1L, 4 C下保存
13、6个月。注意：可通过添加叠氮化钠（0.2g/L）增加此缓冲液的稳定性。室温2年。必须在pH调完 后再加入叠氮化钠。酸化的叠氮化钠会释放出有毒气体。设备:1. 玻璃试管（圆底;16x120mm或18x150mm）2. 离心机（3,000rpm）3微量移液器（100uL）.4. 连续分配器5. 分析天平.6. 分光光度计 510nm.7. 漩涡混合器8. 定时钟9. 沸水浴锅和试管夹注意事项:1.G0P0D试剂的孵育时间没有严格规定，但是至少要20分钟，并在60分钟内测定吸光度. 2每次试验必须设定试剂空白对照和葡萄糖对照（100 ug,四倍）。a）试剂空白对照:0.1mL蒸馏水+3.0mLGOP
14、OD溶液b）葡萄糖对照包括:0.1mL葡萄糖标准溶液（100卩g/0.1mL）+3.0mLG0P0D溶液。因子F （页码13和14 ）通过D-葡萄糖在标准分析中读得的吸光度进行计算（例如100/1.038=96.386）。3. 每次试验必须设定标准面粉或淀粉样品4每一新批此的GOPOD溶液,必须验证其与100卩g葡萄糖标准反应产生颜色所需要的最长 时间, 通常为15分钟左右。样品空白:样品空白按照标准试验程序（example A）进行，将第4步修正为添加3mL蒸馏水，第5 步中也用蒸馏水替代其中的淀粉葡糖苷酶.也可以用样品前处理中所用的酒精作为样品空白 （ example E）。样品准备示例A
15、不含抗性淀粉，D-葡萄糖和麦芽糊精的谷物和食物（建议的程序，pH50孵育）。1. 研磨谷物，过0.5mm筛（35目）。2. 将研磨后样品（准确称量100mg）加入到试管中（16x120m m）,确保全部样品位于试管底部。3. 加入0.2mL乙醇溶液（80%v/v）湿润样品帮助分散，用漩涡混合器混合。4. 立即加入3mL耐热a -淀粉酶（100mM醋酸钠稀释），在沸水浴中孵育6分钟（在孵育2分钟,4 分钟，6分钟的时强烈振荡试管）.注意:在这一步中强力震荡是关键，目的是确保浆状样品能完全的混匀（去除块状）。同 样，每间隔2分钟振荡也是为了防止由于酒精蒸发导致某些样品被喷出试管。如果使用聚丙 烯管，增加孵育时间至12分钟，在 4, 8和12强烈震荡。5将试管放置于50 C的水浴锅中，加入0.1mL瓶2成分（淀粉葡糖苷酶,330U在淀粉上）。 充分混合，在50 C下孵育30分钟。6. 将全部的溶液转移到 100mL 的容量瓶中，用洗瓶冲洗试管，并也倒入容量瓶中，然后用蒸馏 水调整溶液体积，充分混匀。取部分溶液离心（3,000rpm,10分钟）。取清澈的未稀释的上清用 于分析。注意：对于含有1-10%淀粉的样品，在第6步中用蒸馏水调整溶液至10mL,充分混匀, 离心（3,000rpm,10分钟），该溶液可
