免疫组化实验方法

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1、免疫组化是应用免疫学基本原理-抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结 合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 （荧光素、酶、金属离子、 同位素） 显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、 定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术（Immunohistochemistry）或 免疫细胞化学技术（ Immunocytochemistry）。详细实验方法免疫组化实验方法实验材料 组织芯片试剂、试剂盒 PBS 缓冲液 柠檬酸盐缓冲液 EDTA 缓冲液 TBS 缓冲液 酶消化液甲醇-H2O2溶液 封裱剂仪器、耗材 高压锅 电炉 医用微波炉一、免疫组化（lmmunohistochemistry

2、,IHC/ Immunocytochemistry, ICC） 原理免疫组化是应用免疫学基本原理-抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原 理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 （荧光素、酶、金属离子、同位素） 显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研 究，称为免疫组织化学技术（ Immunohistochemistry ）或免疫细胞化学技术（ I mmunocytochemistry）。众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特 性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免 疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再

3、用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免 疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再 与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是 无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用 显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或 组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从 而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能 作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激 素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。免疫组织化

4、学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白 法、免疫金法及放射免疫自影法等。用于病理诊断的主要有免疫荧光法和免疫酶法。免疫荧光法是现代生物学和医学 中广泛应用的方法之一，包括荧光抗体和荧光抗原技术，具有抗原抗体反应的特 异性，染色技术的快速性，在细胞或组织上定位的准确性，以及荧光效应的灵敏 性等优势。但是，由于免疫荧光法必须具有荧光显微镜，荧光强度随时间的延长 而逐渐消退，结果不易长期保存等缺点，在普及应用上受到一定限制，而逐渐被 免疫酶法所取代。二、IHC/ICC实验方法1、仪器设备（1）18cm 不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；（2）水浴锅。2、试剂（1）PBS 缓冲液（

5、pH7.27.4）： NaCI 137mmol/L,KCI 2.7mmol/L,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L。（2）0.01moI/L柠檬酸盐缓冲液（CB,pH6.0,1000mI）:柠檬酸三钠3g,柠檬酸 0.4g。（3）0.5moI/L EDTA 缓冲液（pH8.0）： 700ml 水中溶解 186.1gEDTA2H2O, 用 10 mmoI/L NaOH 调至 pH8.0,加水至 1000mI。(4) 1mol/L 的 TBS 缓冲液(pH8.0):在 800ml 水中溶解 121gTris 碱，用 1 N的HCl调至pH8.0,加水至1000m

6、l。(5) 酶消化液：a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2 (pH7.8)配制。b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。(6) 3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。( 7)封裱剂：a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液(pH9.09.5)等量混合；b、油和TBS (或 PBS)配制。(8) TBS/PBS pH9.09.5,适用于荧光显微镜标本；pH7.07.4适合于光学显微镜标本。3、操作流程( 1 )脱蜡和水化脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60C恒温箱中烘烤20分钟。1) 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；

7、2) 无水乙醇中浸泡5分钟；3) 95%乙醇中浸泡5分钟；4) 70%乙醇中浸泡5分钟；( 2)抗原修复用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。1 )抗原热修复在沸水中加入EDTA (pH8.0)或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)。盖上不 锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻 片在缓冲液中浸泡5 分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。 10 分钟后， 去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或 核抗原的抗原修复。2) 煮沸热修复电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)至95C左右，放入组 织芯片加热1015分

8、钟。3）微波热修复在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入， 断电，间隔510分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR, Bax, Bcl-2, C-fos, X-jun， C-kit， C-myc， E-cadherin ， Chromogranin A， Cyclin， ER， Heat sh ock protein， HPV， Ki-67， MDMZ， p53， p34， p16， p15， P-glycoprotein， PKC, PR, PCNA, ras, Rb, Topoismerasell等。4）酶消化方法常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶

9、液。胰蛋白酶使用前预热至37C，切片也 预热至37C,消化时间约为530分钟；胃蛋白酶消化37C时间为30分钟。适 用于被固定遮避的抗原,其中有： Collagen, Complement, Cytokeratin, C-er B-2, GFAP, LCA, LN 等。（ 3）免疫组织化学染色常见的染色方法有两种：SP法，SABC法。以下分别列出两种方法的实验步骤。SP 法1 ）脱蜡、水化；2）PBS洗23次各5分钟；3）3%H2O2 （80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟4）PBS洗23次各5分钟；5）抗原修复；6）PBS洗23次各5分钟；7）滴加正常山羊血清封闭液,室温 20 分钟

10、。甩去多余液体。8）滴加I抗50卩1，室温静置1小时或者4C过夜或者37C1小时。9）4C过夜后需在37C复温45分钟。10）PBS 洗 3 次各 5 分钟；11）滴加II抗4050卩1,室温静置，或37C1小时；12）抗中可加入 0.05%的 tween-20.13） BS 洗 3 次各 5 分钟；14）DAB 显色 510 分钟，在显微镜下掌握染色程度；15）PBS 或自来水冲洗 10 分钟；16）苏木精复染 2 分钟，盐酸酒精分化；17）自来水冲洗 1015 分钟；18）脱水、透明、封片、镜检。SABC 法1）脱蜡、水化。2）PBS 洗两次各 5 分钟。3）用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%

11、H2O2,室温封闭510分钟，蒸馏水洗3次。4）抗原修复。5）PBS 洗 5 分钟。6）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。7）滴加I抗，室温1小时或者4C过夜或者37C1小时（4C过夜后在37C复 温 45 分钟）。8）PBS 洗三次每次 2 分钟。9）滴加生物素化二抗， 20C 37C20 分钟。10）PBC 洗 3 次每次 2 分钟。11 ）滴加试剂 SABC, 20C37C20 分钟。12）PBS 洗 4 次每次 5 分钟。13）DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。14）蒸馏水洗。苏木素复染2 分钟、盐酸酒精分化。15）脱水、透明、封片、镜检。