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1、免疫学技术的快速进展对精度的要求越来越高，一般的酶免检测技术已渐渐无法适应这种形势的需要。现今进展的主流已不再是用放射性同位素标记的测定方法(避开污染环境及对人体损害)，而是转向于能在任何地方操作的快速均相和固相测定，最终趋向于能够枪测到皮克或10负18 摩尔级的、非同位素的、自动或半自动的试验室测定技术，发光免疫分析技术顺应了这一潮流，开创了免疫诊断的纪元。发光免疫分析是一种灵敏度高、特异性强、检测快速及无放射危害的分析技术。70年月末以来得到了快速进展，目前在国际上已经实现商品化和产业化的发光免疫分析产品，根本上可以分为：化学发光、时间区分荧光(也称时间延迟光致发光)、电化学发光(也称场致
2、发光和电致发光)几种。1、化学发光化学发光是指在化学反响过程中发出可见光的现象。通常是指有些化合物不经紫外光或可见光照耀，通过吸取化学能(主要为氧化复原反响)，从基态激发至激发态。退激时通过跃迁(或将激发能转移至受体分子上)，释放能量产生光子，以光形式放出能量从而导致的发光现象。其主要特点为消耗发光剂。同时量子效率相对较低。1.1 按化学反响类型分类：可分为酶促化学发光和非酶促化学发光两类。其中酶促化学发光主要包括辣根过氧化物酶 (HRP)系统、碱性磷酸酶 (ALP)系统、黄嘌呤氧化酶系统等。酶促发光的共同特点为发光过程中作为标记物的酶根本不被消耗，而反响体系中发光剂充分过最，因此发光信号强而
3、稳定，且发光时间较长。因此可承受速率法测量， 故检测方式简洁、本钱较低。酶促反响的主要缺点为工作曲线可能随时间漂移，而且低端斜率简洁呈非线性下移。而非酶促化学发光包括吖啶酯系统、草酸酯系统、三价铁一鲁米诺系统等。非酶促发光的共同特点为发光过程中标记物被消耗，同时作为标记物的发光剂是发光反响的瓶颈，即含量总是相对缺乏，因此发光信号持续时间较短；假设直接在免疫反响杯中启动发光反响，由于发光剂被很快消耗，故只能进展一次性测量。所以重复性较差。为降低检测本钱并实现重复测量，目前普遍承受原位进样加流淌池的时间积分测量方式。因此仪器本钱及维护费用较高，而且反复使用的流淌池可能导致穿插污染；并目冲洗或进样中
4、产生的气泡也会干扰测定；同时繁琐冗长的冲洗过程也会成为提高检测效率的瓶颈。另外，使用磁性或非磁性微粒时，猛烈的散射吸取作用也会降低灵敏度。1.2 按发光持续时间分类：可分为闪光和辉光两类，闪光型发光时间在数秒内，如吖啶酯系统。其检测方式一般承受原位进样和时间积分法测量，即在检测器部位加装进样器，并保证参加发光剂和检测 2 个过程同步进展；同时以整个发光信号峰的面积为发光强度。而辉光型发光时间在数分钟至数格外钟以上，如HRP 一鲁米诺系统、ALPAMPPD 系统、黄嘌呤氧化酶-鲁米诺系统等。其信号检测无需原位进样，一般以速率法测量，即在发光信号相对稳定的区域任意点测量单位时间的发光强度。测量化学
5、发光反响的光强度，求得某些化学物质和生物物质的含量，尤其与免疫学方法结合以后形成的化学发光免疫测定法(CLIA)， 其既具有发光检测的高度灵敏性，又具有免疫分析的高度特异性，检测快速，试剂无放射危害，检测限达10负15 molL。1.3 评价：化学发光标记物已广泛应用于抗原、半抗原和抗体的检测，与放射性核素标记物相比较，它的优点在于安全(无放射危害)、稳定、测量快速、灵敏度高、线性范围宽、自动化程度高、削减了人为的误差。检测快速缩短了等待结果的时间，无需批量检测可随到随测保证准时供给结果。缺点在于一般化学发光是标记催化酶或化学发光分子的发光反响，一般发光不稳定，为问断的、闪耀性发光，而且在反响
6、过程中易发生裂变，导致反响结果不稳定。此外。检测时需对结合相、游离相进展分别，操作步骤多，测试本钱高。主要问题是化学发光的产生通常是瞬间完成的，发光的峰值很快衰减，再是本底较高和干扰阻碍应用。1.4 代表仪器1.4.1 美国拜耳公司最诊断产品 ACS：180系列全自动化学发光免疫分析系统，以吖啶酯作为标记，量度 AE 标记物化学反响所产生的光量为根底，灵敏度可达10负15 gmL。1.4.2 美国雅培公司生产的 AxSYM 系列全自动免疫发光分析仪将3种技术于一机，可用于非均相标记微粒子酶免发光分析 (MEIA)、离子捕获发光分析(ICIA)和均相标记荧光偏振免疫发光技术(FPIA)，目前已有
7、80多个检测工程可供临床应用。1.4.3 美国贝克曼库尔特公司 AccessOR 全自动微粒子化学发光免疫分析系统。承受 ALP-AMPPD 发光系统，以微粒子作为载体，外表积大、结合快、到达最大发光信号时间短、反响及分别速度快，缩短了分析时间，有效提高了灵敏度和准确性。该系统可全自动把握整个测定和数据分析处理，具有批量和任选测定 24个工程的力量和急诊插入功能，平均检测速度100/h。冷藏试剂盘可放24种试剂，探针直接插入试剂盒并自动封闭，直至试剂用完，不污染不铺张。超声波技术被用于搅拌使微粒悬液混均匀并加速反响，用于探针取样液面检查保证取样准确，用于洗涤时削减穿插污染。使用 AccessO
8、R 的用户还可以申请Internet 全球通讯网络，进展通讯查询。AccessOR 独特的塑料智能化外形设计，使其从外观到内在品质，给人们留下深刻的印象。1.4.4 美国DPC 公司全自动化学发光免疫分析仪IMMULlTE， 以ALP 为标记物，以金刚烷作发光底物，测定灵敏度相当于10负21molml 的酶，承受聚苯乙烯珠作载体，其检测水平已能到达10负12g ml。目前能够检测性腺类、甲状腺功能类、肿瘤标记物类、传染病类、细胞因子类、血液病类、糖尿病类、肾上腺功能类、治疗药物类、成瘾药物类、短肽及其他分析物类，还能供给象肌钙蛋白(TNI)这类急诊工程的快速诊断试剂盒。2、电化学发光分轿2.1
9、 电化学发光2.1.1 电化学发光的原理是对电极施加肯定的电压进展电化学反响，反响的产物之间或与体系中某种组分发生化学发光，用一般光学手段测髓发光光谱军强度从而对物质进展衡量分析的一种方法。与化学发光有所不同，其差异在予氧化反响是通过电极上的电化学反响产生的，而不是氧化剂或发光剂自身内氧化产生，其标记物为三联吡啶钌及其衍生物Ru(bpy)3 2+，并以三丙胺(TPA)为复原荆。如图1所示，Ru(bpy)32十穰 TPA 分剃在弼投袅嚣氧化成 Ru(bpy)3 3+搬TPA 的阳离子自由基 IPA+，IPA+快速脱去一个质子形成 TPA 自由基，TPA 具有强的复原性，从而把 Ru(bpy)33
10、+复原为激发态的Ru(bpy)32+，后者放射一个620 nm 的光子回到基态再参与下一次电化学发光。必需0.01毫秒就可发出稳定的光，每毫秒几十万次的循环电化学发光， 大大提高了分析的灵敏度。另外，通过电极反响在线制备了不稳定的发光剂 Ru(bpy)32+TPA，避开了直接使用 Ru(bpy)3 2+对分析测试的影响。2.1.2 电纯学发光的主要特点是发光过程中的标记物根本不被消耗，丽反响体系中其他成分充分过量，因此发光倍号强而稳定， 且发光时间较长。其缺点为测量方式简单、仪器本钱及维护费用高； 同时环境及样品中同类元素也存在较弱的本底干扰。反复使用的流淌池可能导致穿插污染；而冲洗或进样中产
11、生的气泡也会干扰测定；同时繁琐冗长的冲洗过程也会成为提高检测效率的瓶颈。另外使用磁性或非磁性微粒时，猛烈的散射吸取作用也会降低灵敏度。2.2 免疫电化学发光分析：集电化学发光、生物素一抗生物索、免疫分析和由固相免疫分析进展起来的磁微球等技术于一体，是众多学科穿插的争辩领域。免疫学的核心问题是抗原一抗体的特异性结合，主要承受固相的方法，马上抗原或抗体固定到磁微球上，经免疫反响后，在固相载体磁微球上形成抗原一抗体复合物，外加磁场沉降这种复合物，然后洗涤除去多余或游离的抗体或抗原，然后进展电化学发光测定。与一般免疫反响类似，可分为直接法、双抗体夹心法和竞争法。2.3 免疫毫纯学发光鹣瘟曩毫纯学发光综
12、合了光学、电子学、生物学、免疫学和计算机，禚临床中可糟予以下几个方面。(1) 蛋白质和激素测定：电化学发光技术在激素的测定中有替代放射免疫的趋势。可检测甲状腺激素、促甲状腺激索、性激素、雌二醇、促激索、促黄体激索、人绒毛膜促性腺激素、胰岛素、胰岛素样生长因子、甲状腺降钙素、肿癌标志物、前列腺特异性抗原、肌钙蛋白、甲胎蛋白、癌胚抗原、肿瘤坏死因子、r 干扰素、人体肿瘤相关糖蛋白、自细胞介素系列等。2.3.1 毒素与病毒抗原分析：如肉毒杆菌毒索、蓖麻蛋翻、霍乱亚基和葡萄球菌肠毒素等，检测限达10-15g。还有炭疽杆菌芽孢、伤寒沙门菌、鼠疫抗原等沙门菌和。O 一157病毒等。2.3.2 DNARNA
13、 核酸序列分析：在核酸分析中利用电化学发光技术将 Ru(bpy)3+标记引物或探针进展 DNA 杂交分析或聚合酶链反响，是试验室定量分析标 本中核酸含量的一种有进展前景的检测方法。该技术述可用于检测乙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒等其他致病性病毒和病原微生物。2.3.3 其它物质的检测：还可对其他一些微量物质进展测定，如维生索、叶酸、免疫球蛋白及酶类，人免疫球蛋白、人血清清蛋白、人中性粒细胞溶菌酶、葡萄糖和除草荆等。2.4 评价：电化学发光是一种电促发光技术，承受的是特别的化学发光剂 Ru(bpy)3+作为标记物并在发光反响中循环使用，既避开了同位素的半衰期短及放射蚀危害，又抑制了酶标记的不稳定
14、性， 而标记物很稳定，在室温下半衰期大于1年；同时还结合了90年月初期问世的链霉亲和素的型固相技术，不但使检测的融敏度大大提 高，而且还可自动分别游离相和结合相，使检测更易实现自动化。电化学发光的反响时间仅为20 min，而且标准曲线储存在条码中，每次测定只需一点标定，Ru(bpy)3+的稳定性很好，在室温下半衰期长达1 年。这些优点打算了操作的快速、简捷，无需经常校正。因此该技本与其它的分析手段比较，在免疫学检测中有显著的优势。它的优点除了灵敏度高、特异性强、检测快速外，更为可取的是所用试剂毒性低，无放射性危害，并且有良好的稳定性。以最易受影响的促甲状腺素为例，353周后，电化学发光试剂仍旧
15、稳定。电化学发光分析方法多样，适用面较大，广泛地应用于抗原、半抗原和抗体的免疫梭测。其线性范围也较宽，符合临床检验的需要。耐它与一般的化学发光比较，前者为电促发光，在电极外表通过三角形脉冲电压的激发产 生稳定、连续、高效的发光，后者则是标记辣根过氧化物酶作用下催化化学发光剂(如鲁米诺、吖啶酯等产生不稳定、连续、闪耀性的发光)，基反响过攘中简洁发 像裂变恧使结果不稳定。电亿学发光测定的照光度裰据释放光子的波长仍属荧光测定酶范畴， 但与直接的荧光发光不同，荧光发光的灵敏度受荧光发光的本底和光学部件散射光的影响，适应范围也较低。电化学发光技术的进展趋向在于合成的发光标记物、优化标记技术和免疫分析方法
16、，从而追踪生命科学进展的前沿领域，建立对生命过程有重要意义的内源性和外源性物质的分析方法。2.5 代表仪器：目前生产电化学发光仪的厂家较少，主要生产厂家是瑞士罗氏诊断公司，与德国 BoehringerMannheim 宝灵曼公司公司合 作，Elecsysl0lO20lO，ROCHE 2022系列全自动电化学发光免疫分析仪(ORIGEN 分析仪)。标本可随时插入常规操作中并优先测试，也为临床急诊测定供给了便利。3、时间区分荧光3.1 时间区分荧光免疫分析(TR-FIA)TR-FIA 是将三价稀土镧系离子铕(Eu)，钐(Sin)等通过络合物标记到抗原或抗体分子上，并通过检测其荧光实现免疫分析。由于稀土离子荧光的激发光波长范围较宽，而放射光波长范围较窄，而且激
