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1、第2课时第3章 基因工程基因工程的基本操作程序（二）人教版选择性必修3学习活动学习总结学习目标学习目标1.能阐明将目的基因导入受体细胞的方法2.能阐明目的基因的检测与鉴定的方法3.了解PCR和电泳鉴定的基本原理，尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR产物学习目标学习总结学习活动学习活动阐明将目的基因导入受体细胞及目的基因的检测与鉴定的方法任务1：阅读教材P81“资料卡”及P82最后两段，回答以下问题，归纳总结将目的基因导入不同细胞的方法。目标一（1）什么是转化？（2）农杆菌具有哪些适合介导转化的特点？（3）农杆菌转化法的过程是怎样的？（4）如何将目的基因导入大肠杆菌细胞？（5）培育乳腺生物
2、反应器，应将目的基因导入动物的什么细胞？最常用的方法是什么？学习目标学习总结学习活动学习活动阐明将目的基因导入受体细胞及目的基因的检测与鉴定的方法任务1：阅读教材P81“资料卡”及P82最后两段，回答以下问题，归纳总结将目的基因导入不同细胞的方法。目标一种类项目种类项目植物细胞植物细胞动物细胞动物细胞微生物细胞微生物细胞常用方法受体细胞转化过程农杆菌转化法显微注射法Ca2处理法体细胞受精卵原核细胞目的基因插入Ti质粒的TDNA上导入植物细胞整合到受体细胞的DNA中表达目的基因表达载体提纯取卵(受精卵)显微注射受精卵发育获得具有新性状的动物Ca2处理细胞能吸收周围环境中DNA分子的生理状态细胞重
3、组的基因表达载体导入细胞中学习目标学习总结学习活动学习活动三、将目的基因导入受体细胞将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌转化法农杆菌的特点：农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力；农杆菌细胞内含有的 Ti 质粒上的 T-DNA 可转移至受体细胞，并且将其整合到该受体细胞染色体 DNA 上。学习目标学习总结学习活动学习活动转化过程转化过程：学习目标学习总结学习活动学习活动（2）基因枪法 单子叶植物单子叶植物中常用的一种基因转化方法，但是成本较高。中常用的一种基因转化方法，但是成本较高。将目将目的基因吸附在微小的金粒或钨粒表面，然后将微粒
4、用基因枪高速的基因吸附在微小的金粒或钨粒表面，然后将微粒用基因枪高速射入受体细胞或组织。射入受体细胞或组织。用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。（3）花粉管通道法学习目标学习总结学习活动学习活动将目的基因导入动物细胞（1）常用方法：显微注射技术（2）常用受体细胞：受精卵（3）基本操作程序：将含有目的基因将含有目的基因的表达载体提纯的表达载体提纯获得受精卵获得受精卵取卵取卵早期胚胎培养早期胚胎培养胚胎移植胚胎移植发育成为具有发育成为具有新性状的动物新性状的动物显微注射显微注射学习目
5、标学习总结学习活动学习活动将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞（1 1）原核生物的特点原核生物的特点：繁殖快繁殖快、多为单细胞多为单细胞、遗传物遗传物质相对较少质相对较少等。早期的基因工程操作都用原核生物作等。早期的基因工程操作都用原核生物作为受体细胞，其中以为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛大肠杆菌应用最为广泛。（2 2）操作过程操作过程：对受体细胞的常用处理方法是：对受体细胞的常用处理方法是氯化钙氯化钙法法。首先用。首先用CaCa2+2+处理大肠杆菌细胞处理大肠杆菌细胞感受态细胞感受态细胞将重将重组表达载体组表达载体DNADNA分子与感受态细胞混合分子与感受态细胞混合感受态
6、感受态细胞吸收细胞吸收DNADNA分子。分子。学习目标学习总结学习活动学习活动注意说明注意说明将基因表达载体（重组质粒）导入农杆菌的常用方法是 Ca2+处理法。Ca2+（或 CaCl2 溶液）对微生物细胞的作用是增加细胞壁的通透性。目的基因能否在植物细胞内稳定保存并表达的关键是目的基因是否插入到受体细胞染色体 DNA 上（原理是基因重组）。不同种类的受体细胞：对于植物来说，受体细胞可以是受精卵和体细胞；对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，受精卵具有体积大、易操作、经培养可直接表达性状的优点。学习目标学习总结学习活动学习活动【思考与讨论】下面为利用农杆菌转化法制备转基因植物的过程图，据图回答下列
7、问题：【提示】原因是农杆菌中的Ti质粒上的TDNA(可转移的DNA)可转移至被侵染的细胞，并且整合到该细胞的染色体DNA上。（1）在用土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，一定要将目的基因插入到Ti质粒的TDNA上的原因是什么？学习目标学习总结学习活动学习活动【思考与讨论】下面为利用农杆菌转化法制备转基因植物的过程图，据图回答下列问题：【提示】基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时，要用Ca2处理农杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，利于重组质粒的导入。（2）将基因表达载体导入农杆菌细胞时，应怎样处理农杆菌细胞？学习目标学习总结学习活动学习活动任务2：阅读教
8、材82页，列表归纳目的基因的检测与鉴定方法检测水平操作对象检测方法检测目的分子水平检测目的基因是否稳定维持检测目的基因是否成功转录检测目的基因是否成功表达个体水平检测个体是否获得相应性状受体细胞的染色体DNAPCR技术PCR技术mRNA提取蛋白质抗原-抗体杂交转基因的个体抗虫、抗病接种实验学习目标学习总结学习活动学习活动四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定（1）分子水平的检测a.PCR等技术在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA或mRNA杂交，若出现杂交带，则目的基因插入成功或转录出相应的mRNA。检测受体细胞的染色体DNA上是否插入
9、了目的基因检测目的基因是否转录出了mRNA学习目标学习总结学习活动学习活动b.抗原抗体杂交技术检测目的基因是否翻译成相应的蛋白质从转基因棉花中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交，若出现杂交带，则目的基因成功翻译出蛋白质。学习目标学习总结学习活动学习活动（2）个体生物学水平的检测转基因生物鉴定方法成功标志成功标志抗虫植物抗病毒（菌）植物抗盐植物抗除草剂植物获取目的基因产物的转基因生物饲喂害虫（抗虫接种实验）害虫死亡病毒（菌）感染（抗病接种实验）未出现病斑盐水浇灌正常生长喷洒除草剂正常生长提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较功能、活性正常学习目标学习总结学习活动学习活动【知识总结】1.目
10、的基因的检测与鉴定：学习目标学习总结学习活动学习活动DNADNA片段的扩增及电泳鉴定片段的扩增及电泳鉴定探究探究实践实践实验原理实验原理（1）DNA 片段的扩增片段的扩增利用利用 PCR 可以可以在体外进行在体外进行 DNA 片段的扩增片段的扩增。PCR 利用了利用了DNA的热变性原理的热变性原理，通过，通过调节温度调节温度来控制来控制 DNA双链的解聚与结合。双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次一次 PCR一般要经历一般要经历30次循次循环环。（2）DNA 片段的片段的电泳鉴定电泳鉴定 DNA 分子分子具有可解离的基团具
11、有可解离的基团，在一定的，在一定的pH下，这些基团可以下，这些基团可以带上正电荷或负带上正电荷或负电荷电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动相反的电极移动，这，这个过程就是电泳。个过程就是电泳。PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中。在凝胶中 DNA 分子的分子的迁移速率迁移速率与凝胶的浓度、与凝胶的浓度、DNA 分子的大小和构象等有关分子的大小和构象等有关。凝胶中的。凝胶中的 DNA 分子通过分子通过染色染色，可以在波长为可以在波长为300 nm 的紫外灯下被检测出来的
12、紫外灯下被检测出来。学习目标学习总结学习活动学习活动材料用具材料用具（1）仪器（2）用具PCR 仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头、电泳装置（包括电泳仪电泳槽等）4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物、DNA 聚合酶、模板 DNA、扩增缓冲液、无菌水、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等PCR仪仪微量离心管微量离心管微量移液器微量移液器电泳装置电泳装置学习目标学习总结学习活动学习活动方法步骤方法步骤（1）DNA片段的扩增用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PC
13、R仪中进行反应。待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）循环程序循环程序变性变性复性复性延伸延伸预变性预变性94,5 min94,5 min/3030次次94,30s94,30s55,30s55,30s72,1min72,1min最后最后1 1次次94,1min94,1min55,30s55,30s72,1min72,1min10倍浓缩的扩增缓冲液倍浓缩的扩增缓冲液5L20mmol/L的的4种脱氧核种脱氧核苷酸的苷酸的等量等量混合液混合液1L20 mol/L的引物的引物I2.5L20 mol/L的引物的引物II2.
14、5LH2O28-33L15U/L 的的 Taq DNA 聚聚合酶合酶12U模板模板DNA510L总体积总体积50L学习目标学习总结学习活动学习活动（2）DNA片段的片段的电泳鉴定电泳鉴定配制琼脂糖配制琼脂糖溶液溶液制备凝胶制备凝胶加样加样电泳电泳观察记录观察记录根据待分离根据待分离DNADNA片段的片段的大小大小，用，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，（，（一般配制一般配制质量体积比质量体积比0.8%0.8%1.2%1.2%）。在沸水浴或微波炉内）。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化加热至琼脂糖熔化。稍冷稍冷却却后，加入适量的后，加入适量的核酸染料核酸染料混匀混匀将将温热温热
15、的琼脂糖溶液的琼脂糖溶液迅速迅速倒入模具，并插入合适大小的倒入模具，并插入合适大小的梳子梳子，以形成，以形成加样加样孔孔。待凝胶溶液。待凝胶溶液完全凝固完全凝固，小心，小心拔出梳子拔出梳子，取出，取出凝胶放入电泳槽凝胶放入电泳槽内。将内。将电电泳缓冲液泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶没过凝胶1mm1mm为宜为宜将扩增得到的将扩增得到的PCRPCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用，再用微量微量移液器移液器将将混合液缓慢注入凝胶的加样孔混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。内。留一个加样孔留一个加样孔加入加入指示分子大指示分
16、子大小的标准参照物小的标准参照物接通电源，根据电泳槽接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离阳极至阴极之间的距离来设定电压，来设定电压，一般为一般为1 15V/cm5V/cm。待。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳时，停止电泳取出凝胶置于取出凝胶置于紫外灯下紫外灯下观察和照相，并与核酸分子量标准参照物比较被扩观察和照相，并与核酸分子量标准参照物比较被扩增产物的大小增产物的大小学习目标学习总结学习活动学习活动注意说明1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。学习目标学习总结学习活动学习活动2024/1/29结果分析与评价结果分析与评价1.1.你是否成功扩增出你是否成功扩增出DNADNA片段？判断的依据是什么？片段？判断的依据是什么？2.2.你进行电
