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1、禽蛋功能性成分的提取与应用第一节 蛋清中功能成分的提取一、蛋清中溶菌酶的提取与应用 (一）溶菌酶的抑菌特性 蛋清溶菌酶主要对G+菌敏感，某些G-菌对酶有抵抗性的原因主要是细胞壁中含有大量6-D-二乙酰胞壁酸，抑制酶的活性，而且G菌的细胞壁中肽聚糖含量很少且都被其他一些膜类物质覆盖，溶菌酶很难进入G-菌细胞壁的肽聚糖层进行作用。很多病原微生物为G-菌，如典型的大肠埃希氏杆菌， 溶菌酶对其抑制作用非常弱，这就限制了溶菌酶作为一种天然食品防腐剂的广泛使用。溶菌酶对一些酵母菌也有抑制作用，原因是尽管酵母不含溶菌酶的主要作用底物一肽聚糖，但一些酵母的细胞表面含有溶菌酶可分解的成分丁质。 (二）蛋清溶菌酶
2、的提取方法 生产溶菌酶常用的原料是鸡蛋清，主要方法有：直接结晶法、阳离子交换法和超滤法等。随着各种新的生物分离技术的出现，用于溶菌酶分离纯化的方 法也越来越多，特别是现在采用的染料亲和色谱、亲和膜色谱、反胶团萃取、 双水相萃取、亲和沉淀等方法。 1.食盐直接结晶法 溶菌酶是一种碱性蛋白质，而蛋清中其他蛋白质的等电点都在酸性范围内。利用这一特点，采用直接结晶法制备溶菌酶，向蛋清 中加入一定量的氯化物、碘化物或碳酸盐等盐类，并调节溶液pH至9.5 10.0，降低温度后，溶菌酶会以结晶形式慢慢析出，而大多数蛋白质仍然存留在溶液中，从而将溶菌酶从蛋清中分离出来。 (1)鸡蛋清样品预处理 将鸡蛋两端敲洞
3、，使鸡蛋清流出。用双层纱布过 滤并混匀，按蛋清2倍体积加入蒸馏水，轻轻搅拌5分钟，使蛋清溶液的稠度均匀。 (2)结晶法提取溶菌酶 向蛋清溶液中缓慢加入5%氯化钠细粉并轻轻搅拌。加完氯化钠后，再用氢氧化钠溶液调节pH至10.0，加入定量标准溶菌酶结品作为晶种。4下静置。待结晶完全后，用布氏漏斗滤出结晶，即得到粗制的溶菌酶晶体。 将制得的粗品结晶溶于适量的蒸馏水中，调节酶液的pH至5.0，静置2小时，过滤除去不溶物，收集起滤液并量出其体积，慢慢加入5%氯化钠细粉，用氢氧化钠溶液调节酶液pH至等电点，向酶液中加入定量标准溶菌酶品种，4静置结晶。待结晶完全后，用布氏漏斗滤出结品。重复上述操作3次，结晶
4、经冷冻干燥后即得精制溶菌酶。 2.阳离子交换法 离子交换法是利用离子交换剂与溶液中的离子之间所发生的交换反应来进行物质分离的操作技术，具有简便、高效、成本低，可自动化连续生产等优点。 (1)鸡蛋清样品预处理 取新鲜蛋清，用4层纱布过滤，除去杂物。用磁力搅拌器搅拌10分钟，均质，速度以不引起蛋清起泡为宜。 (2)离子交换树脂的预处理 称取100克离了交换树脂，用1摩尔/升盐酸1000毫升浸泡12小时，倾出上清液，用清水冲洗至pH为6.0左右，再用80C热水800毫升浸泡4小时，过滤，用1摩尔/升氢氧化钠溶液浸泡12小时，倾出上清液，用清水冲洗至pH为9.0左右。用水浸泡备用。 (3)离子交换法提
5、取溶菌酶 吸附 将蛋清冰浴冷却至5左右，搅拌下加入30%已处理好的D152 离子交换树脂，使树脂全部悬浮在蛋清中。保温搅拌吸附6小时。然后静置分层，弃去上层清液（可回收制备蛋粉），下层树脂用清水反复洗3次，以除去杂蛋白，最后滤干树脂。 洗脱 在上述树脂中加入等体积浓度为10%的硫酸铵溶液，搅拌洗脱 60分钟，滤出洗脱液，重复洗脱树脂3次，合并滤出的洗脱液。 丙酮沉淀法 将上述所得洗脱液，用冰浴降温到4，搅拌下将预冷 到-10的2倍体积的丙酮逐滴加入，放置10分钟，然后离心，收获沉淀。 干燥 将沉淀的盐析物倒入丙酮中，不断搅拌，放置2小时左右，滤除丙酮，放入真空干燥箱40下干燥4小时，得成品。
6、3.超滤法 超滤法通过控制超滤膜孔径大小将不同分子量的混合物溶液进行分离，小分子物质可以通过膜，大分子物质被截留。与传统分离技术相比，其优点是其产品收得率高、杂质少、纯度相对较高，在无菌操作条件下，可直接生产医药级的产品。溶菌酶的分子量远小于其他蛋清蛋白的分子量，因此可用超滤法将溶菌酶从蛋清蛋白中分离出来。 (1)料液前处理工艺 蛋清缓冲液稀释微滤均质分析 蛋清料液调节p为6.0，采用0.2摩尔/升的磷酸盐缓冲液稀释10倍，均质压力为24兆帕下均质，操作温度控制在60以下，使蛋清溶菌酶处于游离状态。 (2)蛋清溶菌酶的超滤工艺 调节料液的pH8.5，采用截留分子质量为3万的PES膜，以连续方式
7、稀释3倍进行超滤。透过液用截留分子质量为3000的PES膜进行浓缩，冷冻干燥后得到蛋清溶菌酶样品。 (三）溶菌酶的应用 溶菌酶广泛存在于动物组织和分泌物中，但尤以鸡蛋清中最丰富。鸡蛋清中溶菌酶的含量约占蛋白总量的3.4%3.5%，特别是蛋清外层稀液中溶菌酶含量较高。溶菌酶主要应用于食品工业及医药、生物领域。 1.在乳制品中的应用 溶菌酶是婴儿生长发育必需的抗菌蛋白，人乳中溶菌酶的含量约是牛乳中的3000倍。在欧洲溶菌酶已广泛用于婴儿食品添加剂，向牛乳及其制品中添加一定量的溶菌酶，可以使牛乳人乳化，能够强化r-球蛋白、血清灭菌蛋白等防御因子，增强婴儿对病菌的抵抗力。在奶酪生产中使用溶菌酶，可以防
8、止奶酪风味变化及其后期起泡。 目前，我国液态乳制品发展迅速，向乳制品特别是巴氏杀菌奶中添加溶菌酶，能有效延长其保存期。另外，由于溶菌酶具有一定的耐高温性，因而也可被用于高温瞬间杀菌奶中。 2.在水产品及肉制品保鲜中的应用 一些新鲜水产品和海产品在一定浓度食盐与溶菌酶混合液中浸渍5分钟，干燥后常温或冷藏贮存，可延长其贮存时间。此外，溶菌酶还可作为香肠、红肠等肉类熟制品和鱼丸等水产类熟制品的防腐剂，并可用于低温肉制品的保鲜。3.在果蔬保鲜中的应用 在杨梅的涂膜保鲜剂中加入溶菌酶，结果发现与不加溶菌酶的处理组相比，其烂果率下降了60%，失重率下降了4.5%。 4.在低度酒类及饮料中的应用 溶菌酶是低
9、度酒的理想防腐剂。在低度酒中添加一定量的溶菌酶可以防止产酸菌的生长，同时对酒的风味无任何不良影响，而且受酒类澄清剂的影响也很小。用溶菌酶代替二氧化硫添加到葡萄酒中，从而大大减少二氧化硫的使用量，以降低二氧化硫过多对人体造成的毒害作用。此外，溶菌酶还可作为防腐剂用于饮料、果汁和料酒中。 5.在其他食品中的应用 溶菌酶对豆鼓、四川泡菜等对热敏感的发酵食品具有杀菌防腐作用，同时避免了高温杀菌对这类食品风味的破坏作用。溶菌酶对豆鼓和泡菜具有防腐抑菌作用，实验结果表明溶菌酶可有效地抑制发酵食 品发生褐变，保持其原有色泽，还可明显地减少食盐用量，降低泡菜和豆瓣的 咸味，提高产品风味。另外，溶菌酶还可作为防
10、腐剂用于蛋糕、奶油等极易腐 败变质的食品中，起到防止其微生物增殖的作用。向保健食品中添加一定量溶 菌酶还可以提高其保健效果。 二、卵黏蛋白的提取与应用 (一）卵黏蛋白的提取方法 提取工艺： 蛋清液稀释调节pH离心沉淀冲洗干燥卵黏蛋白 卵黏蛋白通常是应用等电点沉降法进行分离，这是目前制备卵黏蛋白比较 传统的方法。等电点沉降法分离卵黏蛋白通常包括以下三个过程：沉降、收集、洗脱。鸡蛋清加4倍水稀释后，通过调节pH至4.5，使卵黏蛋白沉降， 用离心过滤的方法收集沉淀。获得的凝胶状的沉淀用水或2%氯化钾反复冲洗，以去除共沉淀蛋白如卵清蛋白和溶菌酶。这种方法是有希望通过改进实现产业规模的，但是沉淀卵黏蛋白
11、即使经过多次洗涤仍然会残留部分其他蛋清蛋白质。 (二）卵黏蛋白的生物活性与应用 以前对卵黏蛋白的研究主要集中在它的黏性及在蛋清液化方面的作用，随着食品工业的发展，尤其是功能食品的出现，对蛋白质的评价已不仅仅在于其营养价值和功能特性，人类关注的焦点逐渐集中在它们的医疗保健等方面，如卵黏蛋白具有抗菌、抗病毒作用，能抑制肿瘤细胞的增殖、提高机体免疫力、降低血清胆固醇等。 三、其他功能性成分的提取与应用 (一）卵转铁蛋白的提取纯化与应用 1.卵转铁蛋白的提取 卵转铁蛋白约占整个蛋清蛋白质的12%13%，形成于鸡的卵巢中。它是由686个氨基酸残基组成的单链糖蛋白。作为转铁蛋白家族中的一员，卵转铁蛋白折登
12、形成两个结构相似的瓣，每个都包含一个铁结合的位点，这个位点位于每个瓣的两个域间裂隙中。卵转铁蛋白的提取过程包括： (1)鸡蛋清的预处理 取新鲜鸡蛋20枚，用水洗净外壳，擦干，用一次性50毫升注射器针头，选择适当的对称位置，各扎一小孔，让鸡蛋清自然流出、鸡蛋清用洗净烘干的小烧杯量取体积并记录。留0.4毫升上清液并加入0.4毫升甘油于-20冻存备用。取20毫升鸡蛋清用水稀释至200毫升，称取氯化钠溶解至稀释液中，使氯化钠的终浓度为0.075摩尔/升，调节pH至9，将稀释液充分搅拌均匀（低速）后，转移至4静置7小时，按质量分数5%加入硅藻土搅拌均匀后，用4层滤纸过滤2遍，将滤液用O.45微米一次性滤
13、器过滤，用10kd超滤膜对微滤液进行超滤浓缩至原体积的1/3，超滤液用于蛋白质的盐析。 (2)盐析分离卵白蛋白 取1毫升超滤浓缩液至洁净的1.5毫升离心管中，做好标记，管中加入无水硫酸铵固体，并立即充分振荡至完全溶解，4盐 析1小时，取盐析混合液4，12000转/分离心15分钟，分别收集上清液与沉淀，沉淀用1毫升磷酸缓冲液充分溶解，调节pH至4.0，收集沉淀，得到进 步纯化的卵白蛋白，取30微升各种盐析浓度的上清液和沉淀进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，染色，脱色。收集上清液与沉淀，聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯度。 (3)DEAE-sepharose F.F.离子交换层析分离卵铁传递蛋白 将透析袋在0.01
14、摩尔/毫升的EDTA中煮沸5分钟，双蒸水洗净检查不漏后，配制1 升0.01摩尔/升Tris-HCI(Tris盐酸），pH6.0对盐析上清液进行透析24时，每12小时更换一次透析液。用恒流泵将透析液泵入层析柱，待样品全部进入层析柱后，用23倍柱体积的0.01摩尔/毫升、pH8.5的（Tris盐酸） 缓冲液冲洗，得到溶菌酶，量取体积并记录，留0.4毫升上清液并加入0.4毫 升甘油，-20冻存备用。用含0.08摩尔/毫升氯化钠的上述缓冲液（体积比A:B=92:8)洗去部分杂蛋白，再用0.1摩尔/毫升氯化钠的上述缓冲液 (体积比A:B=90:10)洗脱得到卵铁传递蛋白，量取体积并记录，留0.4 毫升上
15、清液并加入0.4毫升甘油，-20冻存备用。 2.卵转铁蛋白的纯化 分离卵白蛋白后所得的上清液中含有的卵铁传递蛋白与溶菌酶，其等电点分别为6.6和10.5，它们在中性及弱碱性条件下稳定。所选等电点范围内，溶菌酶带正电荷，不被阴离子交换树脂吸附，随流洗液流出，而卵铁传递蛋白及其他带负电荷的蛋白质被吸附。 采用阴离子交换剂对溶菌酶及卵铁传递蛋白进行分离。采用0.01摩尔/毫升、pH8.5的Tris盐酸缓冲液平衡、上样、冲洗，得到溶菌酶，再用0.08摩尔/毫升氯化钠的上述缓冲液洗去部分杂蛋白，再用0.1摩尔/毫升氯化钠的上述缓冲液洗脱得到卵铁传递蛋白，经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白质纯度达到95%以上。
16、 3.卵转铁蛋白的应用 除了已经证实的抗菌功能，卵转铁蛋白还具有为发育的胚胎运输铁的功能。它的抗菌功能是由于它与微生物竞争铁离子所致，而铁是微生物生长的必需元素。最近的研究表明，不依靠铁离子，卵转铁蛋白在蛋清中也具有抗菌功能。这些抗菌属性说明卵转铁蛋白可以作为一种婴幼儿食品添加剂，它的抗菌成分可以提高婴幼儿的健康。 (二）核黄素结合蛋白的特性与分离纯化技术 核黄素结合蛋白是存在于蛋清和蛋黄中的一种磷糖蛋白，它能够结合核黄素（维生素B2)，在胚胎发育过程中发挥着重要的生物功能。核黄素结合蛋白是由核黄素与脱辅基黄素蛋白结合而成，占蛋清中蛋白质的0.8%1.0%，等电点4.0左右，是蛋清中等电点较低的蛋白质之一。其分子量为32000136000道尔顿，沉降系数为2.
