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1、神经毒理学方法神经毒理学方法神经毒理学神经毒理学n n是研究外源化学物对神经系统各部分所引起的结构和功能损坏作用的一门学科。它主要应用神经解剖、神经病理、神经生化、神经药理和分子生物学的学科的理论和技术，研究神经毒物在机体内的代谢、毒性效应发生的类型、特征、主要的临床表现及其生化和分子机制，为中毒防止提供科学依据。神经毒理学可看作既属于毒理学分支,又深深扎根与神经科学的一门交叉学科 2神经毒理学方法n n任何一种方法和技术决定于它所要解决的问题，反过来，方法和技术的发展必然带来某一学科的发展。鉴于神经毒理学的特点，其研究方法必显示此学科的特点，即神经毒理学研究方法。方法和技术方法和技术学科学科
2、3神经毒理学方法传统毒理学研究方法传统毒理学研究方法n n1.1.体内试验体内试验体内试验体内试验：也称为整体动物试验。实验多采用：也称为整体动物试验。实验多采用哺乳动物，常用哺乳动物，常用8 8种：大鼠、小鼠、家兔、豚鼠、种：大鼠、小鼠、家兔、豚鼠、仓鼠、狗、雪貂（白鼬）和猴等。其结果原则上仓鼠、狗、雪貂（白鼬）和猴等。其结果原则上可外推到人。可外推到人。n n2.2.体外试验体外试验体外试验体外试验：利用游离器官、培养的细胞进行，：利用游离器官、培养的细胞进行，多用于外源化学物对机体急性毒作用的初步筛检、多用于外源化学物对机体急性毒作用的初步筛检、作用机制和代谢转化过程的深入研究。体外试验
3、作用机制和代谢转化过程的深入研究。体外试验系统缺乏整体毒物动力学过程，并且难以研究慢系统缺乏整体毒物动力学过程，并且难以研究慢性毒作用。性毒作用。4神经毒理学方法n n3.人体观察人体观察（急性中毒事故、受控的临床实验），可以直接获得关于人体的毒理学资料，临床毒理学主要研究仅限于低浓度、短时间的接触，并且毒作用应有可逆性。n n4.流行病学研究流行病学研究：对人群的直接观察中取得动物实验所不能获得的资料，优点是接触条件真实。但流行病学研究干扰因素多。5神经毒理学方法神经毒理学研究方法神经毒理学研究方法n n一、神经行为功能评价方法 n n二、神经毒性评价方法 n n三、行为发育毒性测试方法 6
4、神经毒理学方法神经行为功能评价方法神经行为功能评价方法n n行为是机体神经系统功能的最终输出结果，是神经系统功能的综合体现，就目前状况而言，是较理想的体检测试评价指标，可为评价各种神经毒物的毒效应提供有意义的定性和定量依据。n n其特点：行为改变往往出现在器质性损害 之前7神经毒理学方法具体方法如下：具体方法如下：n n一、动物神经系统疾病模型一、动物神经系统疾病模型 1 1、帕金森病、帕金森病 经灵长目动物实验，经灵长目动物实验，MPTP(1-MPTP(1-甲基甲基4-4-苯基苯基-1-1，2 2，3 3，6-6-四氢四氢吡啶吡啶)作为能提供人类非常有意义的作为能提供人类非常有意义的PDPD
5、动物模型动物模型而被接受而被接受 2 2、迟发型神经病、迟发型神经病 鸡作为某些有机磷中毒后引起鸡作为某些有机磷中毒后引起迟发型神经病（迟发型神经病（OPIDNOPIDN）的模型已被国际学术界）的模型已被国际学术界公认。公认。8神经毒理学方法n n二、神经行为功能测试组合二、神经行为功能测试组合 1 1、FIOHFIOH测试组合测试组合 （Finlands Institute of Finlands Institute of Occupational Health,Occupational Health,芬兰职业卫生研究所芬兰职业卫生研究所 ）测试）测试组合组合 2 2、WHO-NCTBWHO
6、-NCTB测试组合测试组合 WHO WHO选定的神经行为核选定的神经行为核心测试组合（心测试组合（neurobehavioral core test neurobehavioral core test battery,NCTBbattery,NCTB）3 3、NESNES方法方法 神经行为评价系统神经行为评价系统(neurobehavioral evaluation system)(neurobehavioral evaluation system)是是19861986年年LetsLets和和BakerBaker提出的一组利用计算机进行测试的测试组提出的一组利用计算机进行测试的测试组合。合。9
7、神经毒理学方法n n四、运动功能测试（一）、人体试验 手提转速度试验 目标瞄准追击试验 简单反应时间试验（二）、动物试验 活动度测定 运动协调功能测试 痛觉测定11神经毒理学方法神经毒性评价方法神经毒性评价方法n n一、神经病理学方法一、神经病理学方法 神经病理形态或组织化学改变是确认神经损神经病理形态或组织化学改变是确认神经损害及其病变可逆性程度的重要手段，也是确认神害及其病变可逆性程度的重要手段，也是确认神经毒性的最经典方法。一般的研究思路，先进行经毒性的最经典方法。一般的研究思路，先进行肉眼观察，并辅以脑的绝对和相对重量；其次，肉眼观察，并辅以脑的绝对和相对重量；其次，在光学显微镜下观察
8、基本病变，确定病变的脑区在光学显微镜下观察基本病变，确定病变的脑区后，可进一步取材作电镜检查。为了确认神经毒后，可进一步取材作电镜检查。为了确认神经毒性的细胞特异性及某些特殊生化过程的影响，需性的细胞特异性及某些特殊生化过程的影响，需用神经系统组织化学等方法检查。用神经系统组织化学等方法检查。12神经毒理学方法 可使用光镜、电镜、激光扫描共聚焦显微镜、免疫组织化学、原位杂交法，受体定位法、荧光素示踪技术和放射性核素示踪技术对神经系统进行形态学观察和功能活动形态定位。如：1998年阮素云报道了低浓度铅对大鼠血脑屏障超微结构的损害；2001年赫秋月报道了丙烯酰胺对小鼠小脑浦肯野细胞的病理改变；20
9、03年杨芳报道不同浓度锂对大鼠原代培养大脑皮层神经元的影响。13神经毒理学方法n n二、生理与生物化学方法二、生理与生物化学方法 目前应用脑内微透技术，微穿技术，磁共振光目前应用脑内微透技术，微穿技术，磁共振光谱技术，高效液相色谱法，免疫印迹法，放射免谱技术，高效液相色谱法，免疫印迹法，放射免疫分析法等测定神经中枢神经递质的释放量及其疫分析法等测定神经中枢神经递质的释放量及其变化。变化。如：如：20032003年李红玉报道了电磁辐射对大鼠海马年李红玉报道了电磁辐射对大鼠海马氨基酸类神经递质水平的影响；胡卫萱报道了甲氨基酸类神经递质水平的影响；胡卫萱报道了甲基汞对脑组织有极大的亲和性，基汞对脑组
10、织有极大的亲和性，20082008年年YumiYumi等发等发现组氨酸可减少脑水肿面积的增加现组氨酸可减少脑水肿面积的增加 14神经毒理学方法n n三、神经电生理学方法三、神经电生理学方法 神经电生理学指标在实验和人群的临床研究中神经电生理学指标在实验和人群的临床研究中都得到了较为广发的应用，可使用脑电图，感觉都得到了较为广发的应用，可使用脑电图，感觉诱发电位，肌电图等测试神经系统的电活动，离诱发电位，肌电图等测试神经系统的电活动，离体的单个神经细胞可用斑片钳和膜片钳技术评价体的单个神经细胞可用斑片钳和膜片钳技术评价单个细胞的单个离子通道及其受体的电活动。单个细胞的单个离子通道及其受体的电活动
11、。如：如：20022002年阮迪云应用膜片钳技术和原位杂年阮迪云应用膜片钳技术和原位杂交技术研究了铅对钾通道亚单位和交技术研究了铅对钾通道亚单位和NMDANMDA受体亚受体亚单位的影响；单位的影响；20032003年桑楠等报道了二氧化硫衍生年桑楠等报道了二氧化硫衍生物对大鼠海马神经元外向钾电流特性的影响。物对大鼠海马神经元外向钾电流特性的影响。15神经毒理学方法n n四、分子生物学方法 神经生物学研究中常用的分子生物学方法有基因的分子克隆，克隆后的基因在人工体外系统或细胞中的表达，PCR扩增核酸分子技术，原位杂交技术，基因芯片等。如：2002年张增利报道了农药对小鼠脑细胞组织c-fos、c-j
12、un、mRNA 表达的影响；2002年逯晓波报道了铅对幼鼠海马区Bcl-2、Fas 蛋白表达的影响；2004年丁晓蓉综述了基因芯片与脑衰老的研究进展。16神经毒理学方法n n五、脑成像技术 脑成像技术很多，有颅骨X射线成像技术、同位素脑扫描、计算机断层扫描、核磁共振成像、正电子发射断层扫描术及单光子发射计算机断层摄影等。如1997年姜锋杰报道了慢性锰中毒颅脑CT的改变，为锰中毒的诊断提供了新的参考依据。17神经毒理学方法行为发育毒性测试方法行为发育毒性测试方法n n一、行为发育毒性测试组合n n二、行为发育毒性研究组合 如：2005年胡前胜报道了宫内铅暴露对大鼠神经行为发育的影响，2009年李
13、洪钧报道了孕中期铅暴露对婴儿神经行为发育影响的研究。18神经毒理学方法 可以说，神经毒理学的研究方法很多，任何研究神经科学的方法如神经生物学、神经生理学、神经生化学、神经病理学、神经药理学、分子神经生物学等方法都适用于神经毒理学。19神经毒理学方法 虽说神经毒理学的研究方法很多，但是这些方法是互为补充的，有些指标也只有在结合其他相关指标时才能很好地予以解释，实际上，由于神经系统的复杂性，单一的指标是不可能全面评价神经毒性，因此将不同指标组合起来进行成套实验是神经毒性评价的主要研究方向。20神经毒理学方法n n此外，我个人认为神经毒理学研究方法还可根据试验的样本来源分为：n n一、人体研究n n
14、二、动物实验n n三、离体组织或细胞实验21神经毒理学方法n n就人体研究而言，其研究方法与动物实验，离体实验有明显的不同，除了对一些特殊的志愿者研究外，所有的神经毒效应不能采用人体进行研究。只能在接触某些神经毒物或中毒后进行某些神经系统功能的临床观察和检测；测定外周血、尿等替代指标，作为评价接触神经毒物的生物标志物；死后的组织病理学检查。22神经毒理学方法n n 动物实验和离体实验的研究和应用应遵守优化、减少及替代（refinement、reduction、replacement）3R原则。n n动物实验：需要建立神经系统毒性损伤的 动物模型。然后可以应用生理、生化和分子生物学的方法检测。此外，转基因或基因剔除动物的实验为从基因水平研究毒作用的种属差异提供了可能。23神经毒理学方法n n离体实验 最常见的办法是从动物体分离得到的神经细胞，在尽量模拟体内环境的体外条件下，使神经细胞仍保持存活、增殖、发育和分化能力，为下一步进行神经毒理学研究提供所需要材料，然后根据实验设计，可应用生理学、生物化学方和分子生物学方法检测。24神经毒理学方法主要参考书目主要参考书目n n毒理学基础 主编：王心如n n现代毒理学概论 主编：顾祖维n n现代毒理学基础 主编：祝寿芬n n医学神经生物学 主编：关新民n n毒理学试验方法与技术 主编：王心如25神经毒理学方法
