第6章 植物基因工程课件

第六章第六章 植物基因工程植物基因工程第一节第一节 植物基因工程的发展现状植物基因工程的发展现状第六章第六章 植物基因工程植物基因工程植物基因工程植物基因工程是以植物为受体的一种基因操作植物基因工程是以植物为受体的一种基因操作即以分子生物学为理论基础，采用基因克隆、即以分子生物学为理论基础，采用基因克隆、遗传转化（根癌农杆菌遗传转化（根癌农杆菌TiTi质粒介导质粒介导 法、基因枪法、基因枪法、原生质体介导法等），以及细胞、组织培法、原生质体介导法等），以及细胞、组织培养技术养技术将外源基因转移并整合到受体植物的基因组中，将外源基因转移并整合到受体植物的基因组中，并使其在后代植株中得以正确表达和稳定遗传，并使其在后代植株中得以正确表达和稳定遗传，从而使受体获得新性状的技术体系。从而使受体获得新性状的技术体系。转基因植物的理论前景和意义通过将目的基因导入农作物、园艺作物中，改变它们的遗传特性，使植物免受病虫的危害，使植物免受病虫的危害，或获得抗除草剂的特性，或获得抗除草剂的特性，或改变种子中淀粉、蛋白质的含量和组成、或改变种子中淀粉、蛋白质的含量和组成、或改变花的形状和颜色，或改变花的形状和颜色，或改变植物的育性和不亲合性以及改变植物的或改变植物的育性和不亲合性以及改变植物的抗逆性等抗逆性等高等植物基因工程的发展历程1983 1983 年年 美国和比利时科学家首次将外源基因导入烟草和胡萝卜美国和比利时科学家首次将外源基因导入烟草和胡萝卜 1994 1994 年年 世界上第一种耐储藏的番茄在美国批准上市世界上第一种耐储藏的番茄在美国批准上市 1995 1995 年年 转基因的抗虫、抗除草剂的玉米和棉花在美国投入生产转基因的抗虫、抗除草剂的玉米和棉花在美国投入生产2000 2000 年年 美国转基因大豆的种植面积首次超过普通大豆美国转基因大豆的种植面积首次超过普通大豆迄今为止迄今为止 世界上共批准了世界上共批准了1212种作物、种作物、6 6大类性状的大类性状的4848个转基因品种个转基因品种进行商业化生产，进行商业化生产，其中包括水稻、玉米、马铃薯、小麦、黑麦、红其中包括水稻、玉米、马铃薯、小麦、黑麦、红薯、大豆、豌豆、棉花、向日葵、油菜、亚麻、甜菜、甘草、卷心薯、大豆、豌豆、棉花、向日葵、油菜、亚麻、甜菜、甘草、卷心菜、番茄、生菜、胡萝卜、黄瓜、芦笋、苜蓿、草莓、木瓜、猕猴菜、番茄、生菜、胡萝卜、黄瓜、芦笋、苜蓿、草莓、木瓜、猕猴桃、越橘、茄子、梨、苹果、葡萄等。桃、越橘、茄子、梨、苹果、葡萄等。抗虫转基因植物抗病转基因植物抗除草剂转基因植物转鱼抗寒蛋白基因的番茄转黄瓜抗青枯病基因的甜椒利用转基因改良植物的品质提高观赏价值英国研究人员最近称，新开发的紫色转基因番茄中含有在深色英国研究人员最近称，新开发的紫色转基因番茄中含有在深色浆果中常见的营养成分，并证明可以防止老鼠体内的癌细胞蔓浆果中常见的营养成分，并证明可以防止老鼠体内的癌细胞蔓延。延。此项研究的重点是花青素，这种抗氧化剂存在于黑莓和黑醋栗此项研究的重点是花青素，这种抗氧化剂存在于黑莓和黑醋栗等浆果中，被认为具有降低癌症、心脏病和某些神经系统疾病等浆果中，被认为具有降低癌症、心脏病和某些神经系统疾病风险的作用。风险的作用。这种蓝玫瑰是转基因玫瑰，被植入这种蓝玫瑰是转基因玫瑰，被植入三色紫罗兰所含一种能刺激蓝色素三色紫罗兰所含一种能刺激蓝色素产生的基因，花瓣因而自然呈现蓝产生的基因，花瓣因而自然呈现蓝色。色。蓝玫瑰由日本三得利公司澳大利亚蓝玫瑰由日本三得利公司澳大利亚分支机构研究培育。完成蓝玫瑰在分支机构研究培育。完成蓝玫瑰在自然环境中的生长实验和研究后，自然环境中的生长实验和研究后，三得利公司计划明年秋季把蓝玫瑰三得利公司计划明年秋季把蓝玫瑰推向市场，预计市场规模可达数百推向市场，预计市场规模可达数百亿日元。亿日元。向小麦插入一种来自烟曲向小麦插入一种来自烟曲霉（霉（Aspergillus Aspergillus fumigatusfumigatus）的肌醇六磷酸）的肌醇六磷酸酶基因，这种小麦的肌醇酶基因，这种小麦的肌醇六磷酸酶最高可以在六磷酸酶最高可以在8989摄摄氏度的时候保持稳定。氏度的时候保持稳定。这种名为肌醇六磷酸酶这种名为肌醇六磷酸酶（phytasephytase，亦称植酸酶），亦称植酸酶）的酶可以帮助人体吸收锌的酶可以帮助人体吸收锌和铁元素。和铁元素。将细菌基因dhlA和dhlB插入转基因烟草的基因组中，清除受污染土壤和地下水的卤化有机污染物。转基因植物可作为一种生物反应器生产药用蛋白和植物次生代谢产物，或生产某生产药用蛋白和植物次生代谢产物，或生产某些有机化合物。些有机化合物。转基因植物为人们研究某一基因功能及其再生长发育中的作用提供了强有力的工具。第二节第二节 植物基因工程方法植物基因工程方法第六章第六章 植物基因工程植物基因工程 一 原生质体介导法概念：概念：以原生质体为受体，借助于特定的化学或物理手段将外以原生质体为受体，借助于特定的化学或物理手段将外源直接导入植物细胞的方法。源直接导入植物细胞的方法。主要方法主要方法:1)PEG1)PEG介导的基因转化介导的基因转化2)2)脂质体（脂质体（liposome)liposome)介导的基因转化介导的基因转化3)3)电激法电激法4)4)激光导入法激光导入法5)5)显微注射法显微注射法1 PEG介导的基因转化 原理：利用化学试剂，如聚乙二醇（利用化学试剂，如聚乙二醇（PEGPEG）聚烯醇）聚烯醇(细细胞促融剂胞促融剂)等，诱导原生质体摄取外源等，诱导原生质体摄取外源DNADNA分子，分子，进入原生质体的外源进入原生质体的外源DNADNA分子就有可能通过某分子就有可能通过某种机制整合到基因组中，完成遗传转化过程。种机制整合到基因组中，完成遗传转化过程。案例：转基因烟草2 脂质体介导基因转化 原理：利用脂类化学物质包裹外源利用脂类化学物质包裹外源DNADNA成球体，通过成球体，通过植物原生质体的吞噬或融合作用把包含外源植物原生质体的吞噬或融合作用把包含外源DNADNA的脂质体转入受体细胞。的脂质体转入受体细胞。特点：转化率高转化率高操作繁琐操作繁琐技术性高技术性高 3 电激法介导基因转化 原理：利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上“电激电激穿孔穿孔“，形成可逆的瞬间通道，形成可逆的瞬间通道,从而促进从而促进 外源外源DNADNA进入原生质体。进入原生质体。特点：转化率高；操作简便转化率高；操作简便 ；容易造成原生质体损伤。；容易造成原生质体损伤。显微注射介导的基因转化原理：利用显微注射仪将外源利用显微注射仪将外源DNADNA直接注入受体的细胞直接注入受体的细胞质或细胞核，从而实现外源基因的转移。质或细胞核，从而实现外源基因的转移。优点：方法简单、转化率高；方法简单、转化率高；纯物理方法，适用于各种植物和材料，无局限性；纯物理方法，适用于各种植物和材料，无局限性；对受体细胞无毒害，有利于转化细胞生长发育；对受体细胞无毒害，有利于转化细胞生长发育；培养过程无需特殊选择系统。培养过程无需特殊选择系统。激光微束介导的基因转化原理：将激光引入光学显微镜聚焦成微米级的微束照将激光引入光学显微镜聚焦成微米级的微束照射培养细胞，在细胞膜上形成能自我愈合的小射培养细胞，在细胞膜上形成能自我愈合的小孔，使加入细胞培养基里的外源孔，使加入细胞培养基里的外源DNADNA流入细胞，流入细胞，实现基因的转移。实现基因的转移。优点：操作简便；工作效率高；无宿主限制，适应于操作简便；工作效率高；无宿主限制，适应于各种动植物；各种动植物；对受体细胞生命活动影响小；对受体细胞生命活动影响小；受体的类型广泛；用于细胞器的基因转化受体的类型广泛；用于细胞器的基因转化二 基因枪法（微弹轰击法）工作原理：将外源将外源DNADNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下将微粒高速射入受体细胞或后在高压的作用下将微粒高速射入受体细胞或组织，微粒上的外源组织，微粒上的外源DNADNA进入细胞后，整合到进入细胞后，整合到植物染色体上并得到表达，从而实现外源基因植物染色体上并得到表达，从而实现外源基因的转化。的转化。动力类型：火药爆炸力；高压气体；高压放电火药爆炸力；高压气体；高压放电 操作步骤 （1）制备DNA微弹；（2）准备靶外植体材料；（3）DNA微弹轰击；（4）培养轰击后的外植体 转化率影响因素 金属微粒金粉颗粒较钨粒性质优良金粉颗粒较钨粒性质优良,但是价格昂贵但是价格昂贵.DNA沉淀辅助剂这些化合物对这些化合物对DNADNA在微粒上的黏附有重要作用在微粒上的黏附有重要作用,但对植物受体细胞也产生一定的伤害但对植物受体细胞也产生一定的伤害.DNA纯度及浓度 微弹速度植物材料内在因素 三、根癌杆菌介导法根癌农杆菌广泛亲染双子叶植物和裸子植物。根据根癌农杆菌诱导植物形成的根瘤中冠瘿碱的不同可将根癌农杆菌分为章鱼碱型、胭脂碱型和农杆碱型章鱼碱型、胭脂碱型和农杆碱型3 3种类型种类型在根癌农杆菌内有一个大的致瘤质粒，简称在根癌农杆菌内有一个大的致瘤质粒，简称TiTi质粒。质粒。Ti Ti 质粒的结构与功能质粒的结构与功能Ti Ti 质粒的图谱质粒的图谱整个质粒整个质粒 160-240 kb 160-240 kb其中其中 T-DNA 12-24 kb T-DNA 12-24 kbtms tms 的编码产物负责：的编码产物负责：合成吲哚乙酸合成吲哚乙酸tmr tmr 的编码产物负责：的编码产物负责：合成植物分裂素合成植物分裂素tmt tmt 的编码产物负责：的编码产物负责：合成氨基酸衍生物合成氨基酸衍生物冠瘿碱冠瘿碱Ti Ti 质粒的结构与功能质粒的结构与功能Ti Ti 质粒致瘤的分子机制质粒致瘤的分子机制损伤的植物根部会分泌出乙酰损伤的植物根部会分泌出乙酰丁香酸和羟基乙酰丁香酸，它丁香酸和羟基乙酰丁香酸，它们能诱导们能诱导TiTi质粒上的质粒上的virvir基因以基因以及根瘤菌染色体上的一个操纵及根瘤菌染色体上的一个操纵子表达。子表达。virvir基因产物将基因产物将TiTi质粒质粒上的上的T-DNAT-DNA单链切下，而根瘤单链切下，而根瘤菌染色体上的操纵子表达产物菌染色体上的操纵子表达产物则与单链则与单链T-DNAT-DNA结合形成复合结合形成复合物，后者转化植物根部细胞。物，后者转化植物根部细胞。Ti Ti 质粒的结构与功能质粒的结构与功能T-DNAT-DNA的染色体整合机制的染色体整合机制T-DNAT-DNA的染色体整合机制的染色体整合机制Ti Ti 质粒的结构与功能质粒的结构与功能 Ti质粒是植物基因工程的一种天然载体，但野生型Ti质粒直接作为植物基因工程载体存在着学多障碍：（1 1）质粒过大，造作困难质粒过大，造作困难 （2 2）大型的）大型的TiTi质粒有多个酶切位点质粒有多个酶切位点 （3 3）植物激素类的影响）植物激素类的影响 （4 4）Ti Ti质粒中存在不起作用的序列质粒中存在不起作用的序列 （5 5）Ti Ti质粒的局限性质粒的局限性1Ti质粒的改造策略Ti Ti 质粒的改造质粒的改造除除去去T-DNAT-DNA上上的的生生长长素素（tmstms）和和分分裂裂素素（tmrtmr）生生物物合合成成基基因因，因因为大量的生长素和分裂素会抑止细胞再生长为整株植物；为大量的生长素和分裂素会抑止细胞再生长为整株植物；除除去去T-DNAT-DNA上上的的有有机机碱碱生生物物合合成成基基因因（tmttmt）；因因为为有有机机碱碱的的合合成成大大量消耗精氨酸和谷氨酸，影响植物细胞的生长；量消耗精氨酸和谷氨酸，影响植物细胞的生长；安装大肠杆菌复制子，使其能在大肠杆菌中复制，以利于克隆操作；安装大肠杆菌复制子，使其能在大肠杆菌中复制，以利于克隆操作；安安装装植植物物细细胞胞的的筛筛选选标标记记，如如 neoneor r 基基因因，使使用用植植物物基基因因的的启启动动子子和和poly