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1、 分类号 密级 国际十进分类号（UDC） 第四军医大学 学 位 论 文 促排卵药物对小鼠胚胎发育的影响及机制研究 （题名和副题名） 尉春华 （作者姓名） 指导教师姓名姚元庆 教授（主任医师） 指导教师单位中国人民解放军总医院妇产科 申请学位级别博士 专业名称妇产科学（生殖医学）论文提交日期2010.04 答辩日期2010.05 论文起止时间2009 年 2 月至 2010 年 3 月 学位授予单位第四军医大学 独独独独 创创创创 性性性性 声声声声 明明明明 秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标
2、注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名： 日期： 保保保保 护护护护 知知知知 识识识识 产产产产 权权权权 声声声声 明明明明 本人完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第四军医大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位仍然为第四军医大学。学校可以公布论文的全部或部分内容（含电子版，保密内容除外
3、） ，可以采用影印，缩印或其他复制手段保存论文。学校有权允许论文被查阅和借阅，并在校园网上提供论文内容的浏览和下载服务。同意学校将论文加入中国优秀博硕士学位论文全文数据库和编入中国知识资源总库 ，同意按中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程规定享受相关权益。 论文作者签名： 导师签名： 日期： 促排卵药物对小鼠胚胎发育的影响及机制研究 研 究 生：尉春华 学科专业：妇产科学（生殖医学） 所在单位：中国人民解放军总医院妇产科 导 师：姚元庆 教授（主任医师） 辅导教师：王 莉 博士 资助基金项目：国家重点基础研究发展计划（课题编号 2007CB948102） 关键词：辅助生殖技术 超排卵 胚胎
4、 植入前 评估 IL-6 中国人民解放军第四军医大学 2010 年 5 月第四军医大学博士学位论文 目目 录录 缩略语表缩略语表1 中文摘要中文摘要4 英文摘要英文摘要8 前前 言言13 文献回顾文献回顾15 正正 文文31 实验一 促排卵对小鼠胚胎发育的影响31 实验二 促排卵对小鼠囊胚基因表达谱的影响46 实验三 促排卵对 IL-6 分泌的影响60 小小 结结71 参考文献参考文献73 个人简历和研究成果个人简历和研究成果 92 致致 谢谢93 第四军医大学博士学位论文 -1- 缩略语表缩略语表 缩略词缩略词 英文全称英文全称 中文全称中文全称 ART Assisted Reproduct
5、ive Technology 辅助生殖技术 PGD Preimplantation Genetic Diagnosis 着床前胚胎遗传学诊断 COH Controlled Ovarian Hyperstimulation 控制性超排卵 IVF-ET In-Vitro Fertilization And Embryo Transfer体外授精 ICSI Intracytoplasmic Sperm Injection 卵胞浆内单精子注射技术 EDTA Ethylenediaminetetraacetate 乙二胺四醋酸 GnRHa Gonadotropin Releasing Hormone A
6、nalogue 促性腺激素释放激素兴奋剂 PCR Polymerase Chain Reaction 聚合酶链反应 FISH Fluorescence In Situ Hybridization 荧光原位杂交 Gn Gonadotropin 促性腺激素 AI Artificial Insemination 人工授精 COH Controlled Ovarian Hyperstimulation 控制性超排卵 OHSS Ovarian Hyperstimulation Syndrome 卵巢过度刺激综合征 PCOS Polycystic Ovary Syndrome 多囊卵巢综合征 eCG Eq
7、uine Chorionic Gonadotropin 马绒毛膜促性腺激素 PMSG Pregnant MareS Serum Gonadotrophin 孕马血清促性腺激素 hCG Human Chorionic Gonadotrophin 人绒毛膜促性腺激素 第四军医大学博士学位论文 -2-EC Early Cleavage 早期卵裂 DFS DNA-Fragmented Spermatozoa 片段化的 DNA 精子 CGH Comparative Genomic Hybridization 比较基因组杂交 BWS Beckwith-Wiedemann Syndrome, 贝威氏综合征
8、AS Angelman Syndrome 安格曼症候群 COCs Cumulus-Oocyte Complex 卵丘-卵母细胞复合体 PBS Phosphate-Buffered Saline 磷酸盐缓冲液 BSA Bovine Serum Albumin 牛血清白蛋白 FSH Follicle-Stimulating Hormone 卵泡刺激素 DPC Day Post Coitum 交配后的天数 KEGG Kyoto Encyclopedia Of Genes And Genomes 京都基因与基因组百科全书 GO Gene Ontology 基因本体论 GAPDH Glyceraldeh
9、yde-3-Phosphate Dehydrogenase 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 RT-PCR Reversed Transcript Polymerase Chain Reaction 反转录聚合酶链反应 Timp-3 Tissue Inhibitor Of Metalloproteinases-3 组织金属蛋白酶抑制剂- 3 qRT PCR Quantitative Real-Time PCR 实时定量聚合酶链反应 MAPK Mitogen Activated Protein Kinase 丝裂原活化蛋白激酶 ECM Extracellular Matrix 细胞外基质 MMP Meta
10、lloproteinases 金属蛋白酶 TGFBI Transforming Growth Factor Beta Induced转化生长因子- 诱导 第四军医大学博士学位论文 -3-MAPK Mitogen-Activated Protein Kinase 丝裂原活化蛋白激酶 EFEMP1 Epidermal Growth Factor Extracellular Matrix Protein 1 表皮生长因子细胞外基质蛋白 1 LY96 Lymphocyte Antigen 96 淋巴细胞抗原 96 H2-K1 Histocompatibility 2, K1, K Region 组织相
11、容性 2 的 k1，k 区 IL-6 Interleukin-6 白细胞介素-6 ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay 酶联免疫吸附法 LIF Leukaemia Inhibitory Factor 白血病抑制因子 CNTF Ciliary Neurotrophic Factor 睫状神经营养因子 OSM Oncostatin M 抑瘤素 M CLCF Cardiotrophin-Like Cytokine Factor 心肌样细胞因子 第四军医大学博士学位论文 -4- 促排卵药物对小鼠胚胎发育的影响及机制研究 博士研究生 ：尉春华 导 师 ：姚元庆
12、教授 第四军医大学唐都医院妇产科，西安 710038 中文摘要中文摘要 研究背景：近 30 年来，辅助生殖技术（assisted reproductive technology, ART）在临床上的广泛使用使许多不育不孕夫妇有了自己的亲生孩子。 但是目前辅助生育技术的成功率比较低,而且临床上 ART后存在多胎妊娠率高引发高的母婴病死。如何提高成功率是各个辅助生殖中心所要解决的问题。为此各国生殖机构人员致力于研究一种更接近生理过程的单个囊胚移植,希望能有效提高妊娠率、降低多胎率。 目前胚胎评估的方法还主要是采用形态学评估，因为是人为操作评估，难免有主观因素介入。着床前胚胎遗传学诊断（preimp
13、lantation genetic diagnosis，PGD）则对胚胎有损伤。因而继续寻找无创的、客观量化的胚胎评估方法预测胚胎发育潜能成为目前生殖医学领域面临的问题之一。 超排卵（controlled ovarian hyperstimulation, COH）是体外受精-胚胎移植（in-vitro fertilization and embryo transfer , IVF-ET）技术中非常重要的方法, 能募集卵母细胞，获得恰当数量的囊胚,为体外受精-胚胎移植技术广泛顺利开展提供了前提和保障。令人失望的是体外授精的受精率和卵裂率比较高，但是移植成功率很低，IVF胚胎多数发生移第四军医大
14、学博士学位论文 -5-植失败，只有少数胚胎能发育到活产。而且超排卵导致子宫内膜容受性降低，妊娠率明显下降，胚胎质量降低。目前，超排卵影响胚胎质量和发育潜能的机制尚不明确，需要对其进行深入研究。阐明促排卵药物对胚胎发育的影响及其可能的机制，为寻找有效的生物学标记物进行准确预测胚胎发育潜能提供了理论基础。 研究目的： 1 采用 ICR 小鼠模型，通过体内体外实验体系，研究超排卵对囊胚发育、胚胎植入的影响。2 通过基因芯片的方法，研究超排卵对小鼠囊胚基因表达谱的影响。3 根据基因芯片的结果，选择编码分泌蛋白的差异基因，通过 ELISA 方法验证胚胎培养液中其分泌蛋白水平的变化，从而为开展早期胚胎的无
15、创性临床诊断提供新思路。 研究方法： 1 通过超排卵受孕与自然受孕获取囊胚，采用体视显微镜进行囊胚形态学观察，测量囊胚直径并分级。2 采用小鼠胚胎植入的体外模型，通过建立囊胚和子宫内膜共培养体系，在 24h,48h 和72h 采用体视显微镜观察，比较自然受孕和超排受孕的囊胚在孵化、黏附和扩展方面的差异。3 应用基因芯片杂交技术，研究超排卵对囊胚基因表达谱的影响。数据采用聚类分析、基因本体论（Gene Ontology, GO）分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia Of Genes And Genomes, KEGG)分析等方法进行处理。4 通过实时定量聚合酶链反
16、应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT PCR）鉴定随机选取的 14 个差异表达基因。5 在差异基因中寻找编码分泌蛋白的基因，采用酶联免疫吸附法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA）法检测超排组和对照组胚胎培养液中 IL-6 蛋白的含量。 结 果 ： 1 通 过 测 量 囊 胚 的 直 径 ， 发 现 超 排 组 囊 胚 的 直 径 为145.376.9m，与对照组（152.665.5m）相比明显减小，统计结果表 明 差 异 非 常 显 著 （ P0.001） 。 此 外 ， 超 排 卵 组 囊 胚 细 胞 总 数第四军医大学博士学位论文 -6-（68.96.9）亦明显少于对照组囊胚细胞总数（76.87.9） （P0.01） 。形态学观察进一步发现，超排组中三级囊胚数为 2.10.20，对照组为0.90.1，差异具有非常显著性意义（P0.05） 。 3 基因芯片杂交结果显示，和对照组相比，超排组囊胚一共有 180个差异表达基因 (1.5 倍, p0.01)，其中有 108
