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1、 第十六章第十六章 高效液相色谱法高效液相色谱法 一、高效液相色谱法的特点一、高效液相色谱法的特点 二、流程及主要部件二、流程及主要部件 三、影响分离的因素三、影响分离的因素 四、高效液相色谱法的主要分离类型四、高效液相色谱法的主要分离类型 概述概述 高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLCHPLC）是是2020世纪世纪6060年代末年代末7070年代初发展起来的一种新型分离年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。手段。一、液相色谱分离原理及分类一、液相色谱
2、分离原理及分类和气相色谱一样，液相色谱分离系统也和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两相由两相固定相和流动相组成。固定相和流动相组成。液相液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流；流动相是各种溶剂。动相是各种溶剂。被分离混合物由流动相液体推动进入被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的
3、差异进行分离。分子尺寸大小的差异进行分离。色谱分离的实质色谱分离的实质是样品分子（以下称是样品分子（以下称溶质）与溶溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。定色谱过程的保留行为。根据分离机制不同，液相色谱可分根据分离机制不同，液相色谱可分为：为：液固吸附色谱、液液分配色谱、化液固吸附色谱、液液分配色谱、化合键合色谱、离子交换色谱以及分子排合键合色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型阻色谱等类型。它是在经典液相色谱基础上，引入了气它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，相
4、色谱的理论，在技术上在技术上采用了高压泵、采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备备速度快、效率高、灵敏度高、操作自速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点动化的特点。为了更好地了解高效液相。为了更好地了解高效液相色谱法优越性，现从两方面进行比较：色谱法优越性，现从两方面进行比较：高效液相色谱法比起经典液相色谱高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于法的最大优点在于高速、高效、高灵敏高速、高效、高灵敏度、高自动化度、高自动化。高速是指在分析速度上。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重
5、力加料，流出速度极慢；而高色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达最高可达103cmmin-1。高效液相色谱法与经典液相色谱法高效液相色谱法与经典液相色谱法 例如分离苯的羟基化合物，例如分离苯的羟基化合物，7个组分个组分只需只需1min就可完成。就可完成。对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约170cm，柱径柱径0.9cm，流动相速度为流动相速度为30cm3h-1，需用需用20多小时才能多小时才能分离出分离出20种种氨基酸；而用高效液相色谱法，氨基酸；而用高效液相色谱法，只需只需lh之之内即可完
6、成。内即可完成。又如用又如用25cm0.46cm的的LichrosorbODS(5)的柱，采用梯度洗脱，可在不的柱，采用梯度洗脱，可在不到到0.5h内分离出尿中内分离出尿中104个组分。个组分。（l l）气相色谱法气相色谱法分析对象分析对象只限于分只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的有机物总数的2020。对于占有机物总数。对于占有机物总数近近8080的那些高沸点、热稳定性差、摩的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。相色谱法进行分离和分析。高效液相色谱法与气相色谱
7、法高效液相色谱法与气相色谱法 （2）液相色谱能完成难度较高的分离）液相色谱能完成难度较高的分离工作，因为：工作，因为：气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。作用，样品分子只与固定相相互作用。而而在液相色谱中，流动相液体也与固定相争在液相色谱中，流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提高选择性增加了一个因夺样品分子，为提高选择性增加了一个因素素。也可选用不同比例的两种或两种以上。也可选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大分离的选择性。的液体作流动相，增大
8、分离的选择性。液相色谱固定相类型多，如离子交换色液相色谱固定相类型多，如离子交换色谱和排阻色谱。等，作为分析时选择余谱和排阻色谱。等，作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可能的。地大；而气相色谱并不可能的。液相色谱通常在室温下操作，较低的液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利于色谱分离条件的选择。温度，一般有利于色谱分离条件的选择。（3）由于液体的扩散性比气体的小）由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，溶质在液相中的传质速率慢，倍，因此，溶质在液相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而在气相色谱柱外效应就显得特别重要；而在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。中，柱外区域扩张可
9、以忽略不计。（4）液相色谱中制备样品简单，回收）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易，样品也比较容易，而且回收是定量的，适而且回收是定量的，适合于大量制备合于大量制备。但液相色谱尚缺乏通用的。但液相色谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应用中，这两种色谱技术是互相补充的。际应用中，这两种色谱技术是互相补充的。目目前前高高效效液液相相色色谱谱法法已已被被广广泛泛应应用用于于分分析析对对生生物物学学和和医医药药上上有有重重大大意意义义的的大大分分子子物物质质，例例如如蛋蛋白白质质、核核酸酸、氨氨基基酸酸、多多糖糖类类、植植物物色色素素、高高
10、聚聚物物、染染料料及及药药物物等等物物质质的的分分离离和分析。和分析。高高效效液液相相色色谱谱法法的的仪仪器器设设备备费费用用昂昂贵贵，操操作作严严格格，这这是是它它的的主主要要缺点缺点。高效液相色谱仪的结构示意见高效液相色谱仪的结构示意见图图20-1，一般可分为，一般可分为4个主要部分：个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统统和检测系统。此外还配有。此外还配有辅助装辅助装置置：如梯度淋洗，自动进样及数据：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。处理等。高效液相色谱仪高效液相色谱仪 其其工作过程工作过程如下：如下：首先首先高压泵高压泵将贮液器中流动相溶剂
11、经过进样器将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，送入色谱柱，然后然后从控制器的出口从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。液相色谱图。高效液相色谱仪高效液相色谱仪1 1高效液相色谱仪高效液相色谱仪2高效液相色谱仪高效液相色谱仪3 3高效液相色谱仪高效液相色谱仪4 4一、高效液相色谱法的特点一、高效液相色谱法的
12、特点1.1.流程流程二、流程及主要部件二、流程及主要部件2.主要部件：主要部件：（1 1）高压输液泵）高压输液泵：主要部件之一，压力：主要部件之一，压力：15015035035010105 5 PaPa应应具具有有压压力力平平稳稳、脉脉冲冲小小、流流量量稳稳定定可可调调、耐腐蚀等特性。耐腐蚀等特性。由于高效液相色谱所用固定相颗粒极由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。它较快流动，必须配备有高压输液系统。它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输液泵、
13、过滤器、压力脉动储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成阻力器等组成，其中，其中高压输液泵是核心部高压输液泵是核心部件件。对于一个好的高压输液泵应符合密对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。等要求。常用的输液泵分为常用的输液泵分为恒流泵恒流泵和和恒压泵恒压泵两种。两种。恒流泵恒流泵特点是在一定操作条件下，输特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关；无关；恒压泵恒压泵是指能保持输出压力恒定，但
14、是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重视性差，它们各有优缺点。时间的重视性差，它们各有优缺点。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称机械泵，它又分称机械泵，它又分机械注射泵和机械往复机械注射泵和机械往复泵泵两种，应用最多的是两种，应用最多的是机械往复泵机械往复泵。高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约（约5 53030cmcm），），所以所以柱外展宽（又称柱外柱外展宽（又称柱外效应）较突出效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起柱外展宽是指色谱柱外的因素所
15、引起的峰展宽，的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱外展宽可分柱前柱前和和柱后柱后展宽。进样展宽。进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此高系统是引起柱前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。效液相色谱法中对进样技术要求较严。（2 2）进样系统）进样系统流路中为高压力工作状态，通常使用耐流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：其结构如图所示：进样装置进样装置 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括括柱管柱管与与固定相固
16、定相两部分。柱管材料有玻璃、两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑聚合材料的其不锈钢、铝、铜及内衬光滑聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。较多。一般色谱柱长一般色谱柱长5 53030cmcm，内径为内径为4 45 5mmmm，凝胶色谱柱内径凝胶色谱柱内径3 31212mmmm，制备柱内制备柱内径较大，可达径较大，可达2525mm mm 以上。以上。（3 3）分离系统）分离系统色谱柱色谱柱 一般在分离前备有一个一般在分离前备有一个前置柱前置柱，前，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离技的性能不洗脱其中固定相，保证分离技的性能不受影响。受影响。柱子装填得好坏对柱效影响很大。柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（对于细粒度的填料（20m）一般采一般采用用匀浆填充法装柱匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，先将填料调成匀浆，然后在高压
