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1、第三章第三章 抗体制药抗体制药二二3 3学时学时1第三章 抗体制药第一页，共六十六页。三、多功能抗体及其制备三、多功能抗体及其制备n近年来，在近年来，在scFv单链抗体的根底上，可单链抗体的根底上，可以把两个或两个以上的以把两个或两个以上的scFv重组在一起，由重组在一起，由此可制备成多价小分子抗体即微型抗体简此可制备成多价小分子抗体即微型抗体简称多价微抗。称多价微抗。n包括双链抗体包括双链抗体diabody，三链抗体，三链抗体triabody，微型抗体，微型抗体minibody及四链及四链抗体抗体tetrabody。2第三章 抗体制药第二页，共六十六页。多功能抗体及其制备多功能抗体及其制备n
2、双链抗体制备方法：化学交联法、粘性蛋白双链抗体制备方法：化学交联法、粘性蛋白结构域融合法和接头长度控制法。结构域融合法和接头长度控制法。n微型抗体：通过基因工程手段采用不同的接微型抗体：通过基因工程手段采用不同的接头把单链抗体头把单链抗体VL-VH)VL-VH)的的VHVH结构域与结构域与IGIG的的CH3CH3结构域融合，形成结构域融合，形成VL-VH-CH3VL-VH-CH3的结构。的结构。此种抗体合成后通过此种抗体合成后通过CH3CH3结构域形成稳定的结构域形成稳定的二聚体形式，发挥其双价微抗的作用。二聚体形式，发挥其双价微抗的作用。n三链抗体：在制备单链抗体时，当接头的长三链抗体：在制
3、备单链抗体时，当接头的长度为度为2 2个或个或2 2个以下氨基酸残基时，或者直接个以下氨基酸残基时，或者直接把把VHVH结构域结构域N N末端与末端与VLVL结构域结构域C C末端相连，通末端相连，通过非共价键而形成三聚体，称三链抗体。过非共价键而形成三聚体，称三链抗体。3第三章 抗体制药第三页，共六十六页。4第三章 抗体制药第四页，共六十六页。抗体融合蛋白抗体融合蛋白n抗体的一局部被非抗体序列替代，所形成的融合蛋白具有新的特抗体的一局部被非抗体序列替代，所形成的融合蛋白具有新的特性，称之为抗体融合蛋白。性，称之为抗体融合蛋白。n根据构建方式的不同，抗体融合蛋白主要分为两种形式：根据构建方式的
4、不同，抗体融合蛋白主要分为两种形式：5第三章 抗体制药第五页，共六十六页。构建抗体融合蛋白的原那么构建抗体融合蛋白的原那么 n将第一个蛋白的终止密码子删除，再接将第一个蛋白的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，上带有终止密码子的第二个蛋白基因，即可实现两个基因的共表达。即可实现两个基因的共表达。n抗体酶，酶抗体酶，酶-抗体型融合蛋白，在药物抗体型融合蛋白，在药物治疗中有广阔的前景，它可在靶向位置治疗中有广阔的前景，它可在靶向位置上将前体药物转化成有效的药物，从而上将前体药物转化成有效的药物，从而防止了对正常组织的损害。防止了对正常组织的损害。6第三章 抗体制药第六页，共六十六
5、页。四、基因工程抗体和抗体工程四、基因工程抗体和抗体工程n抗体研究的三大阶段：抗体研究的三大阶段：1890 1890年白喉抗毒素年白喉抗毒素多克隆抗体多克隆抗体；1975 1975年杂交瘤技术年杂交瘤技术单克隆抗体单克隆抗体；1994 1994年开始年开始基因工程抗体基因工程抗体n基因工程抗体基因工程抗体：不用人工免疫动物和细胞不用人工免疫动物和细胞融合技术，完全用基因工程技术制备人源性融合技术，完全用基因工程技术制备人源性抗体，而且还能利用基因转移和表达技术，抗体，而且还能利用基因转移和表达技术，通过细菌发酵或转基因动物、植物大规模生通过细菌发酵或转基因动物、植物大规模生产抗体。产抗体。7第
6、三章 抗体制药第七页，共六十六页。8第三章 抗体制药第八页，共六十六页。噬菌体抗体库技术的根本方法噬菌体抗体库技术的根本方法 n获取目的基因获取目的基因n抗体库技术的载体抗体库技术的载体n淘筛淘筛n表达与鉴定表达与鉴定9第三章 抗体制药第九页，共六十六页。获取目的基因和载体获取目的基因和载体n获取目的基因获取目的基因：提取：提取mRNA mRNA 经反转录经反转录PCRPCR获取抗体某一特定基因区段，抗体获取抗体某一特定基因区段，抗体基因的组合形式多为单链抗体。基因的组合形式多为单链抗体。n抗体库技术的载体抗体库技术的载体：噬菌体载体具有：噬菌体载体具有噬菌体和质粒的共同特点。噬菌体和质粒的共
7、同特点。10第三章 抗体制药第十页，共六十六页。淘筛、表达与鉴定淘筛、表达与鉴定n淘筛：淘筛：抗原固相化后，对噬菌粒群的吸抗原固相化后，对噬菌粒群的吸附、洗涤和洗脱后再感染扩增，与辅助附、洗涤和洗脱后再感染扩增，与辅助噬菌体超感染获得大容量次级文库，反噬菌体超感染获得大容量次级文库，反复使目的克隆大量扩增。复使目的克隆大量扩增。n表达与鉴定表达与鉴定：目的克隆经过鉴定后，再：目的克隆经过鉴定后，再导入感受态菌，进行可溶性表达。导入感受态菌，进行可溶性表达。11第三章 抗体制药第十一页，共六十六页。噬菌体抗体库技术噬菌体抗体库技术12第三章 抗体制药第十二页，共六十六页。噬菌体抗体库的分类噬菌体
8、抗体库的分类13第三章 抗体制药第十三页，共六十六页。噬菌体展示技术噬菌体展示技术14第三章 抗体制药第十四页，共六十六页。15第三章 抗体制药第十五页，共六十六页。噬菌体抗体库技术的特点噬菌体抗体库技术的特点n模拟天然全套抗体库模拟天然全套抗体库n避开了人工免疫和杂交瘤技术避开了人工免疫和杂交瘤技术n可获得高亲和力的人源化抗体。可获得高亲和力的人源化抗体。16第三章 抗体制药第十六页，共六十六页。噬菌体展示技术最关键的优势噬菌体展示技术最关键的优势17第三章 抗体制药第十七页，共六十六页。噬菌体抗体库技术的优势噬菌体抗体库技术的优势18第三章 抗体制药第十八页，共六十六页。单克隆抗体杂交瘤技
9、术和噬菌体抗体展示技术比较单克隆抗体杂交瘤技术和噬菌体抗体展示技术比较19第三章 抗体制药第十九页，共六十六页。基因工程抗体的表达基因工程抗体的表达 n原核生物：大肠杆菌，分原核生物：大肠杆菌，分 融合表达和分泌融合表达和分泌表达；表达；n真核生物：都是分泌表达，有酵母、昆虫细真核生物：都是分泌表达，有酵母、昆虫细胞、中国仓鼠卵细胞和真菌。胞、中国仓鼠卵细胞和真菌。n转基因植物：转基因植物：烟草烟草n转基因动物：单基因水平。转基因动物：单基因水平。20第三章 抗体制药第二十页，共六十六页。抗体在体外人源化存在的问题抗体在体外人源化存在的问题n操作过程复杂操作过程复杂n本钱高本钱高n抗体的亲和力
10、降低抗体的亲和力降低n抗体不是人体免疫系统自然产生抗体不是人体免疫系统自然产生n异源抗体与免疫系统的配合异源抗体与免疫系统的配合21第三章 抗体制药第二十一页，共六十六页。n最理想的单克隆抗体：最理想的单克隆抗体：100人源化，由人体免疫系统自然产生。人源化，由人体免疫系统自然产生。n全人抗体的理论根底：全人抗体的理论根底：n癌症、病毒、细菌对机体而言均为异己物；癌症、病毒、细菌对机体而言均为异己物；n人体不断受异己物攻击，但免疫系统通人体不断受异己物攻击，但免疫系统通常有去除能力；常有去除能力；n免疫系统通过体液免疫和细胞免疫对异免疫系统通过体液免疫和细胞免疫对异己物做出反响；己物做出反响；
11、n体液免疫就是针对异己物天然地产生抗体液免疫就是针对异己物天然地产生抗体。体。n全人抗体面临的关键问题：持续分泌抗体全人抗体面临的关键问题：持续分泌抗体的人的人B细胞、抗体分泌细胞的保持。细胞、抗体分泌细胞的保持。22第三章 抗体制药第二十二页，共六十六页。23第三章 抗体制药第二十三页，共六十六页。24第三章 抗体制药第二十四页，共六十六页。25第三章 抗体制药第二十五页，共六十六页。26第三章 抗体制药第二十六页，共六十六页。27第三章 抗体制药第二十七页，共六十六页。28第三章 抗体制药第二十八页，共六十六页。29第三章 抗体制药第二十九页，共六十六页。30第三章 抗体制药第三十页，共六
12、十六页。五、抗体诊断试剂五、抗体诊断试剂n抗原和抗体的特异性结合在体内和体外都可抗原和抗体的特异性结合在体内和体外都可呈现某种反响。呈现某种反响。n在体内可表现为溶菌、杀菌、促进吞噬或中在体内可表现为溶菌、杀菌、促进吞噬或中和毒素等作用，可作为药物用于治疗；和毒素等作用，可作为药物用于治疗；n在体外可发生凝集或沉淀等反响，可用能看在体外可发生凝集或沉淀等反响，可用能看出抗体来鉴定抗原，作病原学的诊断和血型出抗体来鉴定抗原，作病原学的诊断和血型测定。测定。31第三章 抗体制药第三十一页，共六十六页。抗体诊断药物分类抗体诊断药物分类 三类：三类：n 血清学鉴定用的抗体类试剂血清学鉴定用的抗体类试剂
13、n 免疫标记技术用的抗体类试剂免疫标记技术用的抗体类试剂n 导向诊断药物导向诊断药物32第三章 抗体制药第三十二页，共六十六页。血清学鉴定用的抗体类试剂血清学鉴定用的抗体类试剂 血清学鉴定 是指用能看出抗体来鉴定未知的抗原型，主要用于疾病的病原菌的诊断和血型鉴定。常用凝集反响。33第三章 抗体制药第三十三页，共六十六页。鉴定病原菌的抗体试剂鉴定病原菌的抗体试剂n用单克隆抗体可以检测出多种病毒中非常用单克隆抗体可以检测出多种病毒中非常细微的株间差异；细微的株间差异；n鉴定细菌的种型和亚种，这是传统血清鉴定细菌的种型和亚种，这是传统血清法或动物免疫幅所做不到的，而且诊断法或动物免疫幅所做不到的，而
14、且诊断异常准确。异常准确。n还可以检查出某些还尚无临床表现的极小还可以检查出某些还尚无临床表现的极小肿瘤病灶，检测心肌梗死的位置和面积，肿瘤病灶，检测心肌梗死的位置和面积，为有效治疗提供方便。为有效治疗提供方便。34第三章 抗体制药第三十四页，共六十六页。常用品种和用途常用品种和用途 n 诊断血清诊断血清n 分群血清分群血清n 分型血清分型血清n 因子血清因子血清n 沙门氏菌属诊断血清沙门氏菌属诊断血清n志贺氏菌属诊断血清志贺氏菌属诊断血清n 病原性大肠埃希氏菌诊断血清病原性大肠埃希氏菌诊断血清35第三章 抗体制药第三十五页，共六十六页。诊断血清的制备步骤诊断血清的制备步骤n制备细菌抗原：细菌
15、接种、培养、收集菌苔、制备细菌抗原：细菌接种、培养、收集菌苔、制成菌液；制成菌液；n免疫动物和制备抗体血清：动物有家兔、马、免疫动物和制备抗体血清：动物有家兔、马、羊、豚鼠；免疫途径：静脉、腹腔、皮下。羊、豚鼠；免疫途径：静脉、腹腔、皮下。接种次数接种次数37次，每次间隔次，每次间隔34天，末次注天，末次注射后射后68天取血样测效价，到达要求，即可天取血样测效价，到达要求，即可采血，离心别离血清。采血，离心别离血清。n诊断血清的诊断方法：直接凝集反响诊断血清的诊断方法：直接凝集反响36第三章 抗体制药第三十六页，共六十六页。37第三章 抗体制药第三十七页，共六十六页。乙型肝炎病毒外表抗原的反向
16、被动血凝诊断试剂乙型肝炎病毒外表抗原的反向被动血凝诊断试剂 38第三章 抗体制药第三十八页，共六十六页。妊娠诊断试剂妊娠诊断试剂 n妇女妊娠后，血液和尿液中的妇女妊娠后，血液和尿液中的HCGHCGhuman human chorionic gonadotrophinchorionic gonadotrophin，人绒毛膜促性，人绒毛膜促性腺激素含量增高，在腺激素含量增高，在3 3个月内到达顶峰。个月内到达顶峰。n此时检测尿液中的此时检测尿液中的HCGHCG，就可确定是否怀孕。，就可确定是否怀孕。39第三章 抗体制药第三十九页，共六十六页。抗ABO血型系统血清n按照人红细胞带有的按照人红细胞带有的A A或或B B种凝集原，可将血型分为种凝集原，可将血型分为A A、B B、ABAB和和O O型型4 4种。种。nABOABO血型抗血清的制备：血型抗血清的制备：1 1、人源性、人源性ABO ABO 血型抗血清是采集健康献血人的血液，凝血型抗血清是采集健康献血人的血液，凝固后，置固后，置4 4 度过夜，使冷抗体吸附在血块上一起除掉。度过夜，使冷抗体吸附在血块上一起除掉。2 2、动物源性、动物源性
