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1、生化药物和基因工程药物分析概论生化药物和基因工程药物分析概论第1页，共51页。一、药物分类一、药物分类 第一节第一节 概概 述述第2页，共51页。1 1生化药物：生化药物：例：氨基酸、多肽、蛋白质、酶等例：氨基酸、多肽、蛋白质、酶等。第3页，共51页。2.2.基因工程药物基因工程药物：以以DNADNA重组技术生产的蛋白质、多肽、酶、重组技术生产的蛋白质、多肽、酶、激素、疫苗、单克隆抗体和细胞生长因子类激素、疫苗、单克隆抗体和细胞生长因子类药物。药物。第4页，共51页。二、种类二、种类氨基酸、多肽与蛋白质类氨基酸、多肽与蛋白质类酶类与辅酶类酶类与辅酶类多糖类多糖类脂质类脂质类核酸及其降解物和衍生
2、物核酸及其降解物和衍生物类药物类药物1 1生化药物生化药物第5页，共51页。2 2基因工程药物的种类基因工程药物的种类 1 1 1 1）激素类及神经递质类药物：）激素类及神经递质类药物：）激素类及神经递质类药物：）激素类及神经递质类药物：人生长激素释放抑制因子、人胰岛素、人生长激素释放抑制因子、人胰岛素、人生长激素释放抑制因子、人胰岛素、人生长激素释放抑制因子、人胰岛素、人生长激素人生长激素人生长激素人生长激素 2 2 2 2）细胞因子类药物：）细胞因子类药物：）细胞因子类药物：）细胞因子类药物：人干扰素人白细胞介素、集落刺激因子、人干扰素人白细胞介素、集落刺激因子、人干扰素人白细胞介素、集落
3、刺激因子、人干扰素人白细胞介素、集落刺激因子、促红细胞生成素促红细胞生成素促红细胞生成素促红细胞生成素 3 3 3 3）酶类及凝血因子类药物）酶类及凝血因子类药物）酶类及凝血因子类药物）酶类及凝血因子类药物第6页，共51页。三、特点三、特点 1.1.生物体的基本生化成分生物体的基本生化成分 2.2.分子量大分子量大:分子量测定分子量测定 3.3.结构难确证结构难确证 4.4.全过程的质量控制：原料、生产过程、全过程的质量控制：原料、生产过程、最终产品最终产品 5.5.生物活性检查生物活性检查第7页，共51页。6.6.安全性检查安全性检查 7.7.效价（含量）测定：效价（含量）测定：理化法理化法
4、：有效成分的含量：有效成分的含量 效价测定和酶活力测定：效价测定和酶活力测定：有效成分有效成分 的生物活性的生物活性第8页，共51页。生化药物和基因药物质量控制的项目：生化药物和基因药物质量控制的项目：生化药物和基因药物质量控制的项目：生化药物和基因药物质量控制的项目：来源与种类来源与种类来源与种类来源与种类 纯度纯度纯度纯度 性状性状性状性状 干燥失重或水分干燥失重或水分干燥失重或水分干燥失重或水分 鉴别鉴别鉴别鉴别 炽灼残渣炽灼残渣炽灼残渣炽灼残渣 氨酸组分分析氨酸组分分析氨酸组分分析氨酸组分分析 生物活性生物活性生物活性生物活性 肽图肽图肽图肽图 热源试验热源试验热源试验热源试验 糖含量
5、糖含量糖含量糖含量 含量分析含量分析含量分析含量分析 第二节第二节 质量检验的基本程序与方法质量检验的基本程序与方法第9页，共51页。一、鉴别一、鉴别 理化鉴别法：化学鉴别法理化鉴别法：化学鉴别法理化鉴别法：化学鉴别法理化鉴别法：化学鉴别法 紫外分光光度法紫外分光光度法紫外分光光度法紫外分光光度法 HPLC HPLC HPLC HPLC法法法法生化鉴别法：酶法生化鉴别法：酶法生化鉴别法：酶法生化鉴别法：酶法 电泳法电泳法电泳法电泳法 等电聚焦法等电聚焦法等电聚焦法等电聚焦法生物鉴别法：家兔惊厥试验生物鉴别法：家兔惊厥试验生物鉴别法：家兔惊厥试验生物鉴别法：家兔惊厥试验第10页，共51页。（一）
6、理化鉴别法一）理化鉴别法 1.1.化学鉴别法化学鉴别法：例：溶菌酶例：溶菌酶-CONH-+Cu-CONH-+Cu2+2+络合显色络合显色第11页，共51页。2.2.紫外分光光度法紫外分光光度法 溶剂：溶剂：溶剂：溶剂：0.01mol/L0.01mol/L0.01mol/L0.01mol/L盐酸盐酸盐酸盐酸例：三磷酸腺苷二钠例：三磷酸腺苷二钠例：三磷酸腺苷二钠例：三磷酸腺苷二钠 浓度：浓度：浓度：浓度：20g/ml20g/ml20g/ml20g/ml 判断：判断：判断：判断：maxmaxmaxmax：2571nm2571nm2571nm2571nm A A A A250250250250/A/A
7、/A/A260260260260：0.170.170.170.170.270.270.270.27。3.3.HPLCHPLC法：法：利用对照品溶液和供试品溶液色谱图的保留利用对照品溶液和供试品溶液色谱图的保留利用对照品溶液和供试品溶液色谱图的保留利用对照品溶液和供试品溶液色谱图的保留时间和肽图谱的一致性进行鉴别。时间和肽图谱的一致性进行鉴别。时间和肽图谱的一致性进行鉴别。时间和肽图谱的一致性进行鉴别。第12页，共51页。4.4.酶法酶法：例：尿激酶的鉴别例：尿激酶的鉴别-气泡上升法气泡上升法 原理：原理：第13页，共51页。方法方法：取取取取小小小小试试试试管管管管，加加加加入入入入尿尿尿尿激
8、激激激酶酶酶酶巴巴巴巴比比比比妥妥妥妥溶溶溶溶液液液液、牛牛牛牛纤纤纤纤维维维维蛋蛋蛋蛋白白白白原原原原溶溶溶溶液液液液，再再再再依依依依次次次次加加加加入入入入牛牛牛牛纤纤纤纤维维维维蛋蛋蛋蛋白白白白溶溶溶溶酶酶酶酶原原原原溶溶溶溶液液液液、牛牛牛牛凝凝凝凝血血血血酶酶酶酶溶溶溶溶液液液液，迅迅迅迅速速速速摇摇摇摇匀匀匀匀，立立立立即即即即置置置置370.5370.5370.5370.5恒恒恒恒温温温温水水水水浴浴浴浴保保保保温温温温，记记记记时时时时。反反反反应应应应系系系系统统统统在在在在3030303040404040秒秒秒秒内内内内凝凝凝凝结结结结，凝凝凝凝结结结结块块块块内内内内有
9、有有有气气气气泡泡泡泡生生生生成成成成，15151515分分分分钟钟钟钟内内内内凝凝凝凝结结结结块块块块溶溶溶溶解解解解，当当当当凝凝凝凝结结结结块块块块溶溶溶溶解解解解时时时时，气气气气泡泡泡泡逐逐逐逐渐渐渐渐上上上上升升升升。以以以以0.9%0.9%0.9%0.9%氯氯氯氯化化化化钠钠钠钠作作作作空空空空白白白白，同同同同法法法法 操操操操作作作作，凝凝凝凝结结结结块块块块在在在在2 2 2 2小小小小时时时时内内内内不不不不溶。溶。溶。溶。第14页，共51页。5.5.电泳法电泳法：以肝素鉴别为例。以肝素鉴别为例。与国家肝素标准品对照，其移动位置相应。与国家肝素标准品对照，其移动位置相应。
10、第15页，共51页。6.6.生物法生物法：利用生物体进行试验来鉴别药物。利用生物体进行试验来鉴别药物。例：家兔惊厥试验鉴别胰岛素。例：家兔惊厥试验鉴别胰岛素。利用胰岛素的降糖作用。给家兔大利用胰岛素的降糖作用。给家兔大剂量注射胰岛素，家兔惊厥，迅速静注剂量注射胰岛素，家兔惊厥，迅速静注50%GS50%GS，惊厥停止。，惊厥停止。第16页，共51页。（二）杂质检查二）杂质检查 一般杂质检查一般杂质检查 特殊杂质检查：原料药纯度分析特殊杂质检查：原料药纯度分析 生产过程中杂质的检查生产过程中杂质的检查 1.1.原料药纯度分析原料药纯度分析：多糖类多糖类-低聚糖、核酸、蛋白质低聚糖、核酸、蛋白质 酶
11、类药物酶类药物-酶催化反应基本产物的分析，酶催化反应基本产物的分析，具有一定活性的其他有关酶的检查。具有一定活性的其他有关酶的检查。第17页，共51页。例例例例：胰蛋白酶中糜蛋白酶的检查胰蛋白酶中糜蛋白酶的检查胰蛋白酶中糜蛋白酶的检查胰蛋白酶中糜蛋白酶的检查 选用选用选用选用N-N-N-N-乙酰乙酰乙酰乙酰-L-L-L-L-酪氨酸乙酯作底物进行糜蛋白酶的酪氨酸乙酯作底物进行糜蛋白酶的酪氨酸乙酯作底物进行糜蛋白酶的酪氨酸乙酯作底物进行糜蛋白酶的限度检查。糜蛋白酶的限度为限度检查。糜蛋白酶的限度为限度检查。糜蛋白酶的限度为限度检查。糜蛋白酶的限度为2500250025002500个胰蛋白酶单位中不
12、个胰蛋白酶单位中不个胰蛋白酶单位中不个胰蛋白酶单位中不得大于得大于得大于得大于50505050单位，按每单位，按每单位，按每单位，按每1mg1mg1mg1mg胰蛋白酶为胰蛋白酶为胰蛋白酶为胰蛋白酶为2500250025002500个单位和每个单位和每个单位和每个单位和每1mg1mg1mg1mg糜蛋白酶为糜蛋白酶为糜蛋白酶为糜蛋白酶为1000100010001000单位，折算成重量，则糜蛋白酶的限度单位，折算成重量，则糜蛋白酶的限度单位，折算成重量，则糜蛋白酶的限度单位，折算成重量，则糜蛋白酶的限度为为为为5%5%5%5%（g/gg/gg/gg/g）。）。）。）。1:1000=x:50 x=0.
13、051:1000=x:50 x=0.051:1000=x:50 x=0.051:1000=x:50 x=0.05（mgmgmgmg）L=0.05/1=5 L=0.05/1=5 L=0.05/1=5 L=0.05/1=5%2.2.生产过程中杂质的检查生产过程中杂质的检查第18页，共51页。（三）安全性试验（三）安全性试验 热源试验热源试验热源试验热源试验 异常毒性试验异常毒性试验异常毒性试验异常毒性试验:急性毒性物质急性毒性物质急性毒性物质急性毒性物质 过敏试验：异性蛋白过敏试验：异性蛋白过敏试验：异性蛋白过敏试验：异性蛋白 降压物质试验：导致血压降低的杂质、组降压物质试验：导致血压降低的杂质、
14、组降压物质试验：导致血压降低的杂质、组降压物质试验：导致血压降低的杂质、组 胺、类组胺胺、类组胺胺、类组胺胺、类组胺第19页，共51页。无菌试验：活菌无菌试验：活菌 基因工程药物中可能杂质与污染物检查基因工程药物中可能杂质与污染物检查 来源于宿主细胞的残留来源于宿主细胞的残留DNADNA，外源性杂质，外源性杂质 致突变试验致突变试验 生殖毒性试验生殖毒性试验第20页，共51页。（四）含量测定（四）含量测定生化药物和基因药物的含量表示方法生化药物和基因药物的含量表示方法：百分含量百分含量：适用于结构明确的小分子药适用于结构明确的小分子药 物或经水解后变成小分子的物或经水解后变成小分子的 药物。药
15、物。生物效价或酶活力单位生物效价或酶活力单位：适用于酶类、适用于酶类、蛋白质类药物。蛋白质类药物。第21页，共51页。含量测定方法含量测定方法：理化分析法理化分析法理化分析法理化分析法：化学分析法：重量测定法、滴定分析法化学分析法：重量测定法、滴定分析法化学分析法：重量测定法、滴定分析法化学分析法：重量测定法、滴定分析法 电化学分析法电化学分析法电化学分析法电化学分析法 光谱分析法：比色法、紫外分光、荧光分光光法光谱分析法：比色法、紫外分光、荧光分光光法光谱分析法：比色法、紫外分光、荧光分光光法光谱分析法：比色法、紫外分光、荧光分光光法 色谱分析法：色谱分析法：色谱分析法：色谱分析法：HPLC
16、HPLCHPLCHPLC法：法：法：法：RP-HPLCRP-HPLCRP-HPLCRP-HPLC、HPIEC HPIEC HPIEC HPIEC、HPGFCHPGFCHPGFCHPGFC、灌注色谱法、灌注色谱法、灌注色谱法、灌注色谱法、HPCEHPCEHPCEHPCE法法法法 酶法酶法酶法酶法：酶活力测定法、酶分析法：酶活力测定法、酶分析法：酶活力测定法、酶分析法：酶活力测定法、酶分析法 电泳法电泳法电泳法电泳法 生物检定法生物检定法生物检定法生物检定法第22页，共51页。1 1电化学分析法电化学分析法 药物膜电极药物膜电极药物膜电极药物膜电极 生物组织膜电极生物组织膜电极生物组织膜电极生物组织膜电极 药物电极药物电极药物电极药物电极 微生物电极微生物电极微生物电极微生物电极 离子选择性电极法离子选择性电极法离子选择性电极法离子选择性电极法 免疫电极免疫电极免疫电极免疫电极 免疫场效应管免疫场效应管免疫场效应管免疫场效应管 酶电极酶电极酶电极酶电极 第三节第三节 常用定量分析方法及其应用常用定量分析方法及其应用 第23页，共51页。2.2.HPLCHPLC法法 1 1）RP-HPLCR
