TGF-β及其伙伴分子Smad4在胃癌组织中的表达 作者：李乐平 靖昌庆 刘洪俊 石玉龙 许晓群【摘要】 目的:探讨TGF-β及其伙伴分子Smad4在胃癌组织中的表达方法：利用逆转录（RT）－PCR技术测定胃癌组织TGF-βmRNA和Smad4mRNA水平，并分析两者与胃癌患者各项临床病理指标间的关系结果:Smad4mRNA在胃癌组织中的阳性表达率明显下降TGF-β和Smad4均与胃癌组织的分化程度、肿瘤大小、浸润深度、淋巴转移和TNM分期有关Smad4 mRNA在胃癌组织分化程度高、肿瘤＜5cm、浸润深度浅、无淋巴转移、TNM分期较早的患者中阳性表达率高TGF-βmRNA在胃癌组织中的阳性表达率明显升高TGF-βmRNA在胃癌组织分化程度高、肿瘤＜ 5cm、浸润深度浅、无淋巴转移、TNM分期较早的患者中阳性表达率低胃癌组织中TGF-β和Smad4表达间呈负相关结论:TGF-β和Smad4共同调节胃癌的发生、发展及其生物学行为 【关键词】 胃肿瘤 逆转录-聚合酶链反应 转化生长因子β·Smad4基因 The correlation of TGF-β and Smad4 in gastric carcinoma 【ABSTRACT】 Objectives: To explore the correlation of Smad4 mRNA and TGF-βmRNA in gastric carcinoma. Methods: The presence of Smad4 mRNA and TGF-βmRNA was measured by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) from 61 gastric carcinomas and 39 normal controls. Results: The positive percentages of Smad4 mRNA in gastric carcinoma were lower than those of normal controls. The positive percentages of TGF-βmRNA in gastric carcinoma were higher than those of normal controls. The expressions of Smad4 mRNA and TGF-βmRNA were all related to histological differentiation, location, tumor size, infiltration, lymph node metastasis and TNM stage. Negative correlation occurred in Smad4 mRNA and TGF-βmRNA. Conclusion: TGF-β and Smad4 may be associated with the carcinogenesis, biological behaviors and prognosis of gastric carcinoma. 【KEYWORDS】 Gastric neoplasms· Reverse transcriptase polymerase chain reaction·Transforming growth factorβ·Smad4 gene Smads作为转化生长因子（TGF）-β超家族细胞内信号传递的中介分子,调控着细胞膜至核的信号转导。
我们通过检测胃癌组织中Smad4 mRNA 和TGFβmRNA的水平来探讨两者在胃癌组织中的表达及其两者间的关系 1 资料与方法 1.1 临床资料 选择2002～2003年在山东省立医院胃肠外科手术切除并经病理证实的胃癌标本61例61例患者中男33例，女28例；≤50岁者30例，＞50岁者31例按Borrmann分型：Ⅰ型8例，Ⅱ型19例，Ⅲ型22例，Ⅳ型12例；按病理类型：乳头状腺癌13例，管状腺癌20例，低分化腺癌10例，黏液腺癌9例，印戒细胞癌6例，未分化癌3例另取39例正常胃黏膜标本为正常对照所取标本切取后用生理盐水漂洗干净后用液氮冷存备用 1.2 试剂与仪器 焦碳酸二乙酯（Diethylpyrocarbonate ，DEPC)购自美国Sigma Chemical公司，溴化乙锭(Ethidium Bromide， EB)购自瑞士Fluka Chemie AG公司，1kb DNA Marker购自MBI公司，SORVALL T21高速低温离心机及配套转子为美国Sorvall Products公司产品，EC250-90多功能电泳仪为美国EC公司产品，ZF-4型多功能紫外投射反射分析仪为上海长明光学电子仪器厂制造。
PTC-150型PCR扩增仪为美国MJ Research公司产品，1D Image Analysis Software凝胶分析系统为美国Kodak公司产品 1.3 检测方法 ①胃癌组织总RNA抽提及定量:取组织标本约100mg，移入组织匀浆器中，加入600ul GIT变性液，匀浆后吸取500μl至Eppendorf管中，每管加入pH4.02 MNaOAc 50μl，颠倒混匀；再加入500μl水饱和酚，轻轻混匀；最后加入100ul氯仿，颠倒充分混匀，冰浴10～15min4℃12000rpm离心10min，吸取上清移至另一新1.5ml Eppendorf管中，加入等体积的异丙醇，-20℃放置1h4℃ 15000rpm离心10min，弃上清，加入100μl GIT变性液，轻轻催打，使沉淀溶解，加入等体积的异丙醇， -20℃放置1h4℃ 15000r/min离心10min，弃上清，用无水乙醇洗一遍，弃上清，自然晾干，溶于适量的无Rnase的去离子水中，直接应用，亦可加入1ml无水乙醇于-70℃保存备用②合成Cdna:采用 Promega 公司 RT-PCR(A3500) 两步法试剂盒 ,按操作说明进行将 RNA 逆转录成 cDNA。
TGFβ1扩增片段为297bp P1 5'CAAGTGGACATCAACGGGTT3' P2 5'GCTCCAAATGTAGGGGGCAGG3' Smad4扩增片段为461bp P1 5'-AAGGATCAAAATTGCTTCAG-3' P2 5'-AGAGTATGTGAAGAGATGGAG-3' Humanβ-actin 扩增片段为539bp P1 5'- GTGGGGCGCCCCAGGCACCA -3' P2 5'- CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC -3' 20μl 逆转录反应体系包括: 细胞总RNA 1μg、M-MLV 1μl、5×RT buffer 4μl、0.1mol DTT 2μl、4×dNTP 1μl、随机引物1μl、去RNase水补至20 μl，快速离心混匀；37℃ 1h，95℃ 10min灭活M-MLV；快速离心使蒸汽沉于管底 ③ＰＣＲ扩增： 取5ul RT产物的0.5ml Eppendorf管中继续加入以下试剂10×PCR Buffer 5μl 、25mM MgCL2 4μl、4×dNTP 1μl、上游引物P1 0.5μl、下游引物P2 0.5μl、超纯水 33μl快速离心混匀；95℃ 5min，冰浴冷却，然后快速离心使蒸汽沉于管底。
加入1μl(1U/μl) Taq DNA聚合酶，快速离心混匀，加入30μl液体石蜡 循环条件：94℃1min；58℃ 1min；72℃ 1min；共35个循环，最后72℃延长7min④电泳鉴定：将凝胶电泳图像输入美国Kodak凝胶分析系统，应用1 D Image Analysis Software进行表达强度分析，按下列公式计算相对灰度值 相对灰度值= TGF-β（或Smad4）表达强度/β-actin表达强度 1.4 统计学处理 用SPSS11.0 for windows统计软件，采用Pearson χ2检验和t检验，Smad4和TGFβ间相关性采用Mantel-Haenszel χ2检验，α=0.05 2 结果 2.1 TGF-βmRNA和Smad4 mRNA在正常胃黏膜和胃癌组织中的表达 TGF-β在39例正常胃黏膜组织中7例表达阳性，阳性率为15.42%；61例胃癌组织中42例表达阳性，阳性率为68.85%；两组间差异有显著性意义比较，P＜0.01（χ2=24.67）正常胃黏膜组织中TGF-βmRNA的相对灰度值为0.95±0.31，胃癌组织中TGF-βmRNA的相对灰度值为1.14±0.38，两组比较，P＜0.01（t=3.83）。
Smad4在39例正常胃黏膜组织中31例表达阳性，阳性率为79.41%；61例胃癌组织中29例表达阳性，阳性率为47.54%；两组间差异有统计学意义（χ2=10.12,P＜0.01）正常胃黏膜组织中Smad4mRNA的相对灰度值为1.13±0.41，胃癌组织中Smad4mRNA的相对灰度值为0.94±0.33，两组比较,P＜0.05（t=2.49）详见图1、2 2.2 TGF-βmRNA和Smad4mRNA与胃癌临床病理特征的关系 TGF-β、Smad44的表达与胃癌患者的年龄、性别及肿瘤部位、大小无关（P均＞0.05），与胃癌组织的分化程度、浸润深度、淋巴转移和TNM分期有关（P均＜0.05）TGF-β在胃癌组织分化程度高、浸润深度浅、无淋巴转移和TNMⅠ、Ⅱ期的患者中阳性表达率高， Smad4在胃癌组织分化程度高、浸润深度浅、无淋巴转移和TNMⅠ、Ⅱ期的患者中阳性表达率低见表1与图3、4 2.3 胃癌组织中TGF-β和Smad4表达之间的关系在61例胃癌患者中有12例同时TGF-β、Smad4表达阳性，2例同时TGF-β、Smad4表达阴性，TGF-β表达和Smad4表达间呈负相关（Mantel-Haenszel χ2=17.09，P<0.05）。
详见表2，图5 3 讨论 TGF-β是一类具有多种生物学功能的多肽类生长因子超家族具有多样生物学作用，它能够调节细胞增殖,分化,形态形成及刺激细胞外基质分泌,抑制免疫反应TGF-β在体外的细胞学研究中发挥抑癌作用，在体内其生物学作用具有复杂性在肿瘤的早期阶段，TGF-β抑制肿瘤的发生，在肿瘤的进展过程中，TGF-β的活性消失，TGF-β由肿瘤组织自分泌或旁分泌方式产生，失去抑制肿瘤的作用，升高的TGF-β使肿瘤细胞免疫逃避，肿瘤细胞增殖加快我们的研究结果显示，TGF-β的阳性率在正常胃黏膜组中为15.42%，在胃癌组织中为68.85%胃癌组织中的TGF-β表达与胃癌分化程度、浸润深度、淋巴转移和TNM分期有关TGF-β在胃癌组织分化程度高、浸润深度浅、无淋巴转移和TNMⅠ、Ⅱ期的患者中阳性表达率高在本研究中，中高分化胃癌组的TGF-β阳性率为54.54%，低分化组为85.71%Ura等［1］的研究支持上述数据另外他还认为胃癌细胞产生的TGF-β能刺激成纤维母细胞增殖,而使胃壁僵硬,形成所谓的“皮革胃”，即BorrmannⅣ型胃癌本文中BorrmannⅣ型胃癌的TGF-β阳性率为91.67%（11/12），BorrmannⅠ、Ⅱ、Ⅲ型胃癌的TGF-β阳性率为63.26%（31/49）（χ2=3.626，P=0.057），可能和样本数量不够大有关。
Choi等［2］发现TGF-β与胃癌浸润深度、胃癌组织中增加的微血管计数正相关,同时,胃癌组织中微血管计数又与其侵袭力和淋巴结转移密切相关这提示TGF-β可。