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1、第九章第九章 临床病原体检测临床病原体检测1提提 纲纲第一节：标本的采集运送、实验室评价和检查方法第一节：标本的采集运送、实验室评价和检查方法第二节：病原体耐药性检测第二节：病原体耐药性检测第三节：临床感染常见病原体检测第三节：临床感染常见病原体检测第四节：病毒性肝炎检测第四节：病毒性肝炎检测第五节：性传播疾病病原体检测第五节：性传播疾病病原体检测第六节：医院感染常见病原体检测第六节：医院感染常见病原体检测病原体检测病原体检测药敏检测药敏检测2教学目的与要求：教学目的与要求：了解掌握临床病原体检查的主要内容（标本采集、标本验收、药敏检查、耐药性检测、临床常见病原体、病毒性肝炎、性传播疾病、医院
2、感染）、检测原理以及临床实际应用的重要意义。3重点与难点重点与难点标本采集的原则及各种检查方法的适用范围及其优缺点药物敏感的常用试验方法及其特点耐药菌检测试验各种类型临床常见病原体的检查甲、乙、丙型肝炎的检测方法各种性传播疾病病原体的检测方法、筛选试验、确诊试验及金标准院内感染定义4提提 纲纲第一节：标本的采集运送、实验室评价和检查方法第一节：标本的采集运送、实验室评价和检查方法第二节：病原体耐药性检测第二节：病原体耐药性检测第三节：临床感染常见病原体检测第三节：临床感染常见病原体检测第四节：病毒性肝炎检测第四节：病毒性肝炎检测第五节：性传播疾病病原体检测第五节：性传播疾病病原体检测第六节：医
3、院感染常见病原体检测第六节：医院感染常见病原体检测5临床细菌学检验的特殊性临床细菌学检验的特殊性依赖于细菌生长依赖于细菌生长l采集时间采集时间（发烧？）（发烧？）l运送方式运送方式（密闭与否，保温与否？）（密闭与否，保温与否？）l感染的细菌种类及生长特征感染的细菌种类及生长特征（苛养菌）（苛养菌）l病人是否使用抗生素病人是否使用抗生素（抗生素的影响）（抗生素的影响）l其他：消毒剂，白细胞吞噬等其他：消毒剂，白细胞吞噬等容易受环境中的细菌污染容易受环境中的细菌污染l采集方法采集方法（无菌操作，避免污染）（无菌操作，避免污染）l放置时间放置时间（及时运送，避免细菌死亡）（及时运送，避免细菌死亡）6
4、基本原则基本原则1：正确的标本类型和采集部位以反映有效病程：正确的标本类型和采集部位以反映有效病程2：采集和运送应无菌操作，避免污染：采集和运送应无菌操作，避免污染3：尽快送检：尽快送检4：视所有标本为传染品，高度污染标本要有明显标识：视所有标本为传染品，高度污染标本要有明显标识5：注意生物安全，标本用后要做消毒处理：注意生物安全，标本用后要做消毒处理一、标本采集和运送一、标本采集和运送7（一）血液标本的采集（一）血液标本的采集适应症：疑似菌血症、败血症或适应症：疑似菌血症、败血症或脓毒血症的病人脓毒血症的病人酒精棉球消毒，防止污染。静脉酒精棉球消毒，防止污染。静脉采血后，将血液注入培养瓶内采
5、血后，将血液注入培养瓶内。采集时间：一般在抗生素使用前，采集时间：一般在抗生素使用前，于发热初期或高峰期采血。于发热初期或高峰期采血。采集频率：采集频率：24小时内采血小时内采血23次可提高阳性率，且在不同部位。次可提高阳性率，且在不同部位。采血量：血液与培养基的比例为采血量：血液与培养基的比例为1：5-10，一般成人血量，一般成人血量510ml，婴儿，婴儿1-5ml。8（二）尿液标本的采集（二）尿液标本的采集首次晨尿，无菌采集中段尿首次晨尿，无菌采集中段尿10-20ml。排尿困难者考虑导尿采集标本。排尿困难者考虑导尿采集标本。如考虑厌氧菌感染，采取膀胱如考虑厌氧菌感染，采取膀胱穿刺法采集标本
6、穿刺法采集标本。9标本送检标本送检标本要求尽快送检，否则影响阳性率。标本要求尽快送检，否则影响阳性率。烈性传染病标本需专人护送。烈性传染病标本需专人护送。16二、标本的实验室质量评估标准二、标本的实验室质量评估标准1标本必须注明姓名、年龄、性别、采集日期、临床诊断、检验项目等基本信自。2仔细核对标本采集日期和送检日期。延误的标本，一般情况下不接收。通常用于细菌学检验的标本的存放不要超过24h。而病毒检测的标本可于4存放23天。3检查送检容器是否完整，有无破损或渗漏等情况，若有则不予接收。4标本储存、运送方式不当，不予接收。5明显被污染的标本不予接收。6标本量明显不足的标本，不予接收。7同一天申
7、请做同一实验的重复送检标本(血培养除外)，不予接收。8对于烈性传染病标本的采集和运送应严格执行相关规定，要有完善的防护措施，按规定包裹及冷藏，附有详细的采样及送检纪录，由专人护送。标本是否合格，以保证检测结果的准确性！标本是否合格，以保证检测结果的准确性！17三、检查方法三、检查方法（一）直接显微镜检查（一）直接显微镜检查（二）病原体特异性抗原检查（二）病原体特异性抗原检查（三）病原体核酸检查（三）病原体核酸检查（四）病原体的分离培养和鉴定（四）病原体的分离培养和鉴定（五）血清学试验（五）血清学试验18（一）直接显微镜检查（一）直接显微镜检查不染色标本不染色标本不染色标本：不染色标本：适用于检
8、查适用于检查生活状态下病原体的动力生活状态下病原体的动力及运动状况及运动状况。方法：方法：压滴法、悬滴法压滴法、悬滴法。意义：在不染色状态下借意义：在不染色状态下借助暗视野显微镜或相差显助暗视野显微镜或相差显微镜观察病原菌的动力、微镜观察病原菌的动力、活动方式。部分病原体可活动方式。部分病原体可借此初步诊断，如梅毒螺借此初步诊断，如梅毒螺旋体。旋体。19（一）直接显微镜检查（一）直接显微镜检查染色标本染色标本染色标本目的：了解细菌的形态、染色性或观察宿主细胞内包涵体。方法：革兰染色、墨汁染色、抗酸染色、荧光染色20革兰染色革兰染色细菌的形态、染色性的特征细菌的形态、染色性的特征细菌的形态、染色
9、性的特征细菌的形态、染色性的特征阳性球菌（阳性球菌（GS）阴阴阴阴性性性性杆杆杆杆菌菌菌菌GG- -RR真菌孢子真菌孢子21墨汁染色墨汁染色荚膜抗吞噬30%-50%的患者伴有免疫功能低下等疾病，8%左右的AIDS患者伴有隐球菌性脑膜炎，预后极差。中枢神经系统存活与脑脊液中缺乏抗体和补体激活系统有关抗真菌治疗:两性霉素B,氟康唑宽厚荚膜宽厚荚膜23抗酸染色抗酸染色荧光显微镜用于标本经荧光染色后直接检出某些病原微生物，荧光显微镜用于标本经荧光染色后直接检出某些病原微生物，荧光显微镜用于标本经荧光染色后直接检出某些病原微生物，荧光显微镜用于标本经荧光染色后直接检出某些病原微生物，用形态学和免疫学相结
10、合的可特异地家侧某些病原微生物的存在。用形态学和免疫学相结合的可特异地家侧某些病原微生物的存在。用形态学和免疫学相结合的可特异地家侧某些病原微生物的存在。用形态学和免疫学相结合的可特异地家侧某些病原微生物的存在。24荧光显微镜用于标本经荧光染色荧光显微镜用于标本经荧光染色荧光显微镜用于标本经荧光染色荧光显微镜用于标本经荧光染色后直接检出某些病原微生物后直接检出某些病原微生物后直接检出某些病原微生物后直接检出某些病原微生物荧光染色荧光染色25SARS（severe acute respiratory syndrome ）病原体的确定。病原体的确定。直接显微镜检查直接显微镜检查电镜检查电镜检查电镜
11、检查不常规用于临床，对某些病毒感染却有确诊的价值电镜检查不常规用于临床，对某些病毒感染却有确诊的价值电镜检查不常规用于临床，对某些病毒感染却有确诊的价值电镜检查不常规用于临床，对某些病毒感染却有确诊的价值26电子显微镜发现为电子显微镜发现为某种冠状病毒某种冠状病毒电镜检查不常规用于临床，对某些病毒感染却有确诊的价值电镜检查不常规用于临床，对某些病毒感染却有确诊的价值电镜检查不常规用于临床，对某些病毒感染却有确诊的价值电镜检查不常规用于临床，对某些病毒感染却有确诊的价值27意义意义1.无菌体液的直接镜检对病原体诊断具有一定意义。2.对正常菌群寄居腔道的分泌物图片镜检可提示进一步检查的步骤、采取的
12、方法和确定分离鉴定病原体所需的培养基。28意义意义3.由于临床标本中常含有一定的抗菌物质，以致分离培养可为阴性，此时的镜检往往可能在诊断是起作用。4.荧光显微镜用于标本经荧光染色后直接检出某些病原微生物5.电镜检查不常规用于临床，对某些病毒感染却有确诊的价值。29(二)病原体特异性抗原检查 利用抗原抗体之间的特异性反应，用已知抗体检测患者血清及其他体液中的待测抗原，借助免疫荧光技术、酶联免疫技术、化学发光技术、胶乳凝集试验、对流免疫电泳等技术检测标本中未知的病原体抗原，其诊断价值常以标本不同而各异。标本中如果存在多种正常寄居微生物，可因交叉抗原存在而不能肯定诊断。检测细菌不同的抗原构造，还可分
13、析细菌的菌群和血清型，如沙门菌属、志贺菌属和霍乱菌属等30O1群霍乱弧菌的血清分型型别别名O抗原成份原型稻叶型A、C异型小川型A、B中间型彦岛型A、B、C细菌的血清分型：细菌的血清分型：O1群群霍霍乱乱弧弧菌菌的的菌菌体体抗抗原原由由A、B、C三三个个抗抗原原成份组成成份组成利用抗原抗体之间的特异性反应，用已知抗体检测患者血清及其他体液中的待测抗原颗粒颗粒颗粒颗粒凝集凝集凝集凝集检测细菌不同的抗原构造，检测细菌不同的抗原构造，还可分析细菌的菌群和血清型，还可分析细菌的菌群和血清型，如沙门菌属、志贺菌属和霍乱菌属如沙门菌属、志贺菌属和霍乱菌属31（三）病原体核酸的检测（三）病原体核酸的检测常用试
14、验方法有：常用试验方法有：1.PCR。polymerasechainreaction聚合酶聚合酶链式反应，简称链式反应，简称PCR技术。技术。2.核酸探针杂交技术核酸探针杂交技术3.RealtimePCR4.基因芯片等基因芯片等32PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自
15、动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖33PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点标准的标准的PCRPCR反应体系反应体系4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0. .12ugTaq DNA聚合酶 2. .5uMg2+ 1. .5mmol/L351234522557294时间（min）温度（）PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍36PCR的基本原理PC
16、R反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA9537PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点9550引物1引物2DNA引物38PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶39PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第1轮结束95第2轮开始40PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点955072TaqTaqTaqTaq41PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第2轮结束42PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增43PCR扩增产物电泳扩增产物电泳44PCRPCR技术的特点技术的特点1 ）高度的灵敏性30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）PCR产物每轮循环增加一倍皮克(pg=10-12)量级扩增到
