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1、 第四章第四章 动物细胞与组织培养动物细胞与组织培养 (Animal Cell and Tissue Culture) 动物体内取出组织和细胞，在体外模拟机体内的生理条件，建立无菌、适温和一定的营养条件，使之生长和生存，并维持其结构和功能的技术，称动物细胞与组织培养。 是动物细胞工程的重要技术根底：细胞融合、组织工程、胚胎工程、干细胞工程、动物克隆、动物细胞产品的大规模制备技术等等都离不开。第一页，共一百一十二页。4.1 概概 述述l l4. 1.1 开展历史开展历史l l4.1.2 动物细胞的特点动物细胞的特点l l4.1.3 动物细胞与组织培养的概念动物细胞与组织培养的概念l l4.1.4
2、 动物细胞的体外培养生长特性动物细胞的体外培养生长特性第二页，共一百一十二页。4. 1.1 开展历史1、动物细胞组织培养技术的起源： 19世纪所应用的胚胎学技术。 动物细胞培养的奠基人：美国生物学家哈里森1907年用盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法将蛙胚神经组织培养在淋巴液中，存活几周，有细胞突起的生长过程。 先驱者中法国学者卡勒尔：设计卡氏培养瓶自1923年用于培养鸡胚的心肌组织成功以后，已使多种动物组织培养获得成功。 第三页，共一百一十二页。4. 1.1 开展历史2、20世纪40年代以后： 动物组织培养的科学家们研究重点集中在培养基方面。3、20世纪80年代以后： 随着基因工程技术和细胞融合技
3、术的迅速发展，已能把特定的外源基因通过PCR技术扩增几千倍，并可转染到细胞内，使其得到高质量的表达。 第四页，共一百一十二页。4. 1.1 开展历史l4、近年：l淋巴细胞杂交瘤技术，使动物细胞培养进入了l一个新领域。杂交瘤细胞能在体外悬浮情况下大l量繁殖并产生单克隆抗体。 l随着基因重组和单克隆抗体技术的开展，动物l细胞组织培养展现出越来越可观的工业化前景。第五页，共一百一十二页。4.1.2 动物细胞的特点动物细胞的特点一动物细胞之间的连接特点： 1.紧密连接：牢固、无间隙。 2.间隙连接： 2-3nm间隙。 3.隔壁连接： 20-30nm间隔，有横隔。 4.中间连接： 无横隔、透明，间隔20
4、-30nm。 5.桥粒连接： 有间隙，有纤维形成的特殊结构。第六页，共一百一十二页。4.1.2 动物细胞的特点动物细胞的特点二动物细胞的培养特点： 1.动物细胞比微生物细胞大，无细胞壁。 2.动物细胞倍增时间长，生长缓慢，易受污染。 3.培养过程需氧量少，对机械搅拌或剪切力敏感。 4.动物细胞间主要以聚集体形式存在。 5.原代细胞一般繁殖50代左右即退化死亡。第七页，共一百一十二页。4.1.3 动物细胞与组织培养的概念动物细胞与组织培养的概念l动物细胞与组织培养：从动物体内取出l细胞或组织，模拟体内的生理环境条件，l在无菌、适宜温度和丰富营养条件下，使l离体细胞或组织生存、生长并维持结构和l功
5、能的一门技术。l是动物细胞工程的重要技术根底。第八页，共一百一十二页。4.1.4体外培养细胞的分型体外培养细胞的分型 贴附和非贴附生长： 1.贴附型细胞：细胞间相互接触；细胞与细胞外基质培养器皿壁或载体结合。多数细胞属贴附型细胞。 2.非贴附型细胞：此类细胞体外生长不必贴壁，可在培养液中悬浮生长。如：白细胞、淋巴细胞，肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞系等。第九页，共一百一十二页。贴附型细胞贴附型细胞(anchorage-dependent cell) 哺乳动物大多数细胞必须附着固体外表生长。当细胞布满表面单层时，即停止生长。假设取走一片细胞 ，存留的细胞就会沿着外表生长而重新布满外表。从生长外表
6、脱落而进入液体的细胞通常不再生长而逐渐退化。为单层附壁培养 按培养细胞的形态，可分四类： 1.成纤维型细胞(fibroblast) 外形与体内成纤维细胞相似，梭形或不规那么形。 细胞贴壁后呈梭形，胞质外伸出2-3个长短不同的突起，成放射状，胞间疏松。 起源于中胚层的细胞在体外培养时一般表现为这种形式。第十页，共一百一十二页。贴附型细胞贴附型细胞2. 上皮型细胞(epithelium)： 泛指形状上类似上皮细胞的细胞。特点：扁平状，形态较为规那么。胞间紧密，单层贴壁。起源于内、外胚层的细胞体外培养时如此。3. 游走型细胞(wandering)： 类似巨噬细胞样的特征。外形不规那么。 分散生长，不
7、连接成片，成群落；通常伸出伪足和突起，贴壁位置不固定，呈活泼的游走和变形运动。 单核巨噬细胞系细胞体外培养常如此：颗粒性白细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、肿瘤细胞。第十一页，共一百一十二页。贴附型细胞贴附型细胞4. 多形型细胞( polymorphic)： 形态上不规那么难以确定其形态的细胞。 细胞胞体略呈多角形；细胞胞突细长形；类似丝状伪足。 如神经元和神经胶质细胞第十二页，共一百一十二页。影响细胞形态的主要因素l细胞的来源不同；l生理条件不同，功能状态不同；l血清成分、培养基成分、 添加成分、培养基的酸碱l度、气象环境、温度等不同。 l 如HeLa细胞原本是一种上皮型癌细胞，但假设在过
8、酸l或过碱的条件下培养，可以呈现梭形，当酸碱适中时l又可以恢复上皮型特征。第十三页，共一百一十二页。非贴附型细胞或悬浮型细胞非贴附型细胞或悬浮型细胞suspend cell 此类细胞体外生长不必贴壁，可在培养液中悬浮生长。如：白细胞、淋巴细胞，肿瘤细胞和杂交瘤细胞以及转化细胞系等。 形态：始终为球状 优点：细胞密度高，培养效率高，易操作控制，便于大规模生长。 有些细胞既可悬浮，也可以贴附。第十四页，共一百一十二页。4.1.5 体外培养细胞的生长特性体外培养细胞的生长特性1、 贴附： 细胞接种后很快形成伪足，与底物点接触，细胞逐渐呈放射状伸展，细胞体中心变扁平状。 影响因素：低钙不利于细胞伸展；
9、低温和培养液流动过快阻碍贴附；生物因素：表皮生长因子刺激神经胶质细胞的皱褶活动、成纤维细胞生长因子减少3T3细胞的扁平度。第十五页，共一百一十二页。4.1.5 体外培养细胞的生长特性体外培养细胞的生长特性2、接触抑制contact inhibition： 正常细胞移动、靠近而接触时，细胞不再移动且停止接触区质膜的皱褶活动和细胞运动以及细胞的重叠生长。肿瘤癌细胞无此现象。3、密度抑制density inhibition： 只要营养充分，接触抑制的细胞仍能分裂增殖。但细胞密度进一步加大、营养减少、代谢产物增多时，因营养和代谢物的影响细胞分裂停止，出现接触抑制。第十六页，共一百一十二页。4.1.6
10、体外培养细胞的生长与增殖过程体外培养细胞的生长与增殖过程 4.1.6.1、细胞系的生长过程： 培养的细胞持续生长的时间有限，最终自行停止生长。细胞的种类、性状、原供体的年龄决定其生存时间长短。 如：人胚成纤维细胞存活一年、传3050代相当于150300个细胞周期；供体是成体或衰老个体时那么存活更短；肝、肾细胞仅能传几代或十几代。 获永生性或恶性转化遗传性改变生存期那么发生变化。第十七页，共一百一十二页。4.1.6.1 细胞系的生长过程：细胞系的生长过程： 1、原代培养期primary culture phage)：从取出体内组织接种培养到第一次传代的时期。14周。 细胞：移动活泼、分裂但不旺盛
11、、相似于也能代表体内组织、药物测试的好对象。 2、传代期passage phase：原代细胞生长一定时间后，将其分开接种到多个培养瓶中继续培养的过程称传代。 细胞系cell line：传代细胞分裂增殖旺盛、能保持一致的二倍体核型，称细胞系。细胞的代数=转接的次数。每一代中细胞分裂36次。第十八页，共一百一十二页。4.1.6.1 细胞系的生长过程：细胞系的生长过程：3、衰亡期senescence phase：细胞仍生存，但不增殖或增殖很慢，最后衰退死亡。 细胞可发生自发转化，其标志之一：获永久增殖能力而成连续细胞系株。连续细胞系株：主要发生在传代期。 细胞系cell line：第一次传代培养后的
12、细胞。 细胞株cell strain：在经过生物学鉴定的细胞系中，通过单细胞培养或筛选法，由单细胞增殖形成的细胞群。 亚株substrain：？第十九页，共一百一十二页。 体 外 培 养 细 胞 系 的 生 长 曲 线0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 t周接种培养第一次传代衰老死亡 传 代 期 细 胞 系连续细胞系原代培养转化传代间隔细 胞 浓 度 的 指 数第二十页，共一百一十二页。 4.1.6.2 每代群体细胞的生长过程每代群体细胞的生长过程 每代细胞要经过四个生长阶段：1、潜伏期latent phase： 接种悬浮贴附不马上分裂潜伏。原初代培养细胞：2496 h；传代和肿
13、瘤细胞：624 h。2、对数生长期logarthmic growth phase： 分裂旺盛、分裂相增多其数量标志分裂的旺盛程度。 细胞分裂指数mitotic index, MI: MI=(分裂相个数1000个细胞) 100% 。初代MI低，传代和肿瘤细胞系MI高达35% 。第二十一页，共一百一十二页。4.1.6.2 每代群体细胞的生长过程每代群体细胞的生长过程 在理想的环境下，细胞处于较恒定的生长分裂状况，其生长速率： dN dt N N时间 t 时的细胞个数； 细胞比生长速率：在对数生长期，群体细胞数增殖一倍所需要的时间，以时间T表示 积分得： T 2 (时间T表示细胞比生长速率) 此时期
14、细胞以指数形式增长繁殖。持续35天。 第二十二页，共一百一十二页。4.1.6.2 每代群体细胞的生长过程每代群体细胞的生长过程 3、稳定期stationary phase：因培养空间和营养物质有限，特别是代谢废物的累积，细胞进入：新分裂的细胞数与死亡的细胞数相等的动态平衡时期。 细胞数不增加，但代谢还是活泼的。 4、衰亡期senescence：营养物的耗尽和有害物质的作用，细胞死亡数大于细胞分裂数。 最高分裂次数限制：正常细胞都有，肿瘤癌细胞没有。 第二十三页，共一百一十二页。细胞浓度的对数潜伏期对数生长期稳定期衰亡期 0 24 48 72 96 120 h每代群体细胞生长的四个时期每代群体细
15、胞生长的四个时期第二十四页，共一百一十二页。4.2 动物细胞与组织培养的根本技术4.2.1 体外培养的特点4.2.2 培养条件和工具4.2.3 原代培养和传代培养技术4.2.4 贴壁培养技术4.2.5 动物细胞培养的传统方法4.2.6 动物细胞大规模培养技术4.2.7 动物细胞生物反响器大规模培养4.2.8 动物细胞培养的现状与展望第二十五页，共一百一十二页。4.2.1 体外培养的特点体外培养的特点 1、动物细胞营养需求苛刻：氨基酸细胞是不能自主合成必须氨基酸的、单糖能源；合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料、维生素辅酶、辅基、其他大量和微量元素、促生长因子和激素促进细胞生长、维持细胞功能、保持细
16、胞分化和未分化状态 2、培养环境条件要求严格：温度、渗透压多数哺乳动物细胞260320mOsmkg、pH及溶氧量CO2和HO-的相对恒定、剪切力等。 3、易污染、防污染：细菌、真菌、病毒；血清和组织材料。第二十六页，共一百一十二页。4.2.2 培养条件和工具培养条件和工具一、培养条件：1. 温度：2. pH：3. 气体：4. 营养：二、培养工具：1. 器皿：2. 载体：第二十七页，共一百一十二页。4.2.2 培养条件和工具培养条件和工具一、培养条件： 1、温度：多数哺乳动物37，偏离那么影响代谢和生长。高温对细胞的威胁更大。 2、pH：最适7.27.4，低于6、高于7.6影响生长甚至死亡。 3、气体：容器空间中O2和CO2细胞代谢的进行。O2 ？ CO2 ？ CO2培养箱？ 4、营养：需要氨基酸、维生素、辅酶、核酸、嘌呤、嘧啶、激素和生长因子。第二十八页，共一百一十二页。4.2.2 培养条件培养条件培养基培养基 1. 天然培养基natural medium：来自动物体液或组织别离提取的培养基。 种类：生物性液体如血清、组织浸液如胚胎浸液、凝固剂如血浆等。 1血清：主要为牛胎牛、新生牛、
