《生物技术制药 课件 4.抗体工程制药-2》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物技术制药 课件 4.抗体工程制药-2（104页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第四节第四节 基因工程抗体基因工程抗体( (Genetic engineering antibody)Genetic engineering antibody)概念概念：采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球：采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。主要包括细胞进行表达，产生新型抗体。主要包括嵌嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体和双特异性抗体。 目的目的：一是降低免疫源性；一是降低免疫源性； 二是降低相对分子量，二是降低相对分子量， 三
2、增加组织通透性。三增加组织通透性。一、单克隆抗体人源化一、单克隆抗体人源化( (humanized humanized antibody)antibody)降低反应降低反应 人一鼠嵌合抗体是将人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合人抗体的恒定区融合而得到的抗体。而得到的抗体。（1 1）嵌合抗体）嵌合抗体( (chimericchimeric antibody) antibody)从杂交瘤细胞分离出功能性从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因可变区基因，与，与人人IgIg恒恒定区基因连接定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表
3、达人表达人- -鼠嵌合抗体。鼠嵌合抗体。特点：特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。人源化程度达到亲本抗体特异性结合抗原的能力。人源化程度达到70%70%左右左右19841984年出现嵌合重组技术，年出现嵌合重组技术，19941994年批准第一个嵌合年批准第一个嵌合抗体药物上市，至今总数已达抗体药物上市，至今总数已达6 6个如：个如：rituxanrituxan , , simulectsimulect , ,remicaderemicade可变区基因的获得可变区基因的获得杂交瘤细胞杂交瘤细胞mRNAmRNA分离分离 c
4、DNAcDNA RT PCR RT PCR VH VH或或VLVL基因基因克隆鼠单抗的可变区基因，可从克隆鼠单抗的可变区基因，可从基因组文库基因组文库中分离，中分离，也可用也可用PCRPCR技术技术分离。分离。Pr 鼠鼠VH 人人 CH Pr 鼠鼠VL 人人 CL免疫球蛋白免疫球蛋白基因载体的构建基因载体的构建H链嵌合载体链嵌合载体L 链嵌合载体链嵌合载体共转染细胞共转染细胞启动子启动子人人- -鼠嵌合抗体基因工程改造策略鼠嵌合抗体基因工程改造策略 VL+人人IgCL载体载体VH+人人Igr1载体载体鼠VH鼠VL人CL人CH抗体分泌细胞抗体分泌细胞人人- -鼠嵌合基因工程抗体鼠嵌合基因工程抗体
5、共转染共转染SP2/0细胞细胞现临床应用的嵌合抗体现临床应用的嵌合抗体RituxanRituxan ( (美罗华美罗华, ,利妥昔单利妥昔单抗抗 ) :) :第一个人源化单抗，第一个人源化单抗，针对针对CD20CD20的人的人/ /鼠嵌合单抗，鼠嵌合单抗，含人含人IgG1IgG1恒定区恒定区, ,用于治用于治疗低度恶性疗低度恶性B B 淋巴瘤淋巴瘤; ; 抗淋抗淋巴瘤作用主要可能来自于补巴瘤作用主要可能来自于补体作用、体作用、ADCCADCC和诱导肿瘤细和诱导肿瘤细胞凋亡胞凋亡Rituximab（1997）MabThera for the treatment of non-Hodgkin-ly
6、mphomasSimulectSimulect；（；（basiliximabbasiliximab 舒莱，巴利西单抗，舒莱，巴利西单抗，诺华诺华) )：嵌合性人：嵌合性人/ /鼠抗鼠抗IL-2IL-2受体受体(CD25)(CD25)单克隆抗单克隆抗体体, ,RemicadeRemicade：（：（infliximabinfliximab, ,英利昔单抗英利昔单抗, ,抗抗TNFaTNFa的的单克隆抗体），治疗炎性肠症单克隆抗体），治疗炎性肠症( (CrohnCrohn氏病氏病),),类风类风湿性关节炎湿性关节炎HerceptinHerceptin( (贺赛汀贺赛汀):):针对针对HER-2/n
7、euHER-2/neu原癌基因产物原癌基因产物的人的人/ /鼠嵌合单抗，特异地作用于鼠嵌合单抗，特异地作用于HER-2HER-2受体过度受体过度表达的乳腺癌细胞表达的乳腺癌细胞 （2 2）改型抗体（人源化抗体）改型抗体（人源化抗体）1.1.将小鼠的将小鼠的CDRCDR（互补决定区）序列移植到人抗（互补决定区）序列移植到人抗体可变区框架中，产生的抗体称为体可变区框架中，产生的抗体称为CDRCDR移植抗移植抗体体。重构抗体重构抗体(Reshaped (Reshaped Antibody)Antibody)为了减少嵌合抗体中鼠源性序列，人们又将鼠抗为了减少嵌合抗体中鼠源性序列，人们又将鼠抗体体V V
8、区（区（H H、L L链链）中的）中的3 3个超变区基因个超变区基因插入人抗体插入人抗体的的V V区的框架（区的框架（FRFR）基因中，这样构建的抗体保留）基因中，这样构建的抗体保留了鼠抗体与抗原结合的特异性。这种抗体几乎百了鼠抗体与抗原结合的特异性。这种抗体几乎百分之百人源化了。分之百人源化了。异源单抗上异源单抗上六个六个CDRCDR通过通过PCRPCR等方法克隆到人抗体等方法克隆到人抗体相应的框架区相应的框架区(FR) (FR) 上构建成新抗体上构建成新抗体Humanizing AntibodiesHumanizing AntibodiesVLVHMouseVLVHHumanVLVHHum
9、anized Antibody with Mouse LoopsCDR序列序列 CDR序列序列 鼠单克隆抗体鼠单克隆抗体 人抗体人抗体人源化抗体（该型抗体人源化抗体（该型抗体） 鼠单克隆鼠单克隆V区人源化（区人源化（CDR移植）移植） 经过经过CDRCDR移植，抗体的免疫原性极低，而其抗原结移植，抗体的免疫原性极低，而其抗原结合能力保持不变，到现在已有数百种人源化抗体。合能力保持不变，到现在已有数百种人源化抗体。人源性可达人源性可达90%90%以上以上现在以及未来几年，人源化抗体药物将占有主体现在以及未来几年，人源化抗体药物将占有主体地位。地位。目前该方法是人源化单抗最常用、最基本的方法目前该
10、方法是人源化单抗最常用、最基本的方法问题问题改型单抗亲和力仅为原来鼠抗体的亲和力的改型单抗亲和力仅为原来鼠抗体的亲和力的1/401/40亲和力下降，亲和力是影响改型单链抗体应用于亲和力下降，亲和力是影响改型单链抗体应用于临床的重要因素临床的重要因素 人人IgIg分子的框架区一些氨基酸与鼠分子的框架区一些氨基酸与鼠IgIg的的CDRCDR区不协区不协调调三维蛋白结构等需进一步丰富三维蛋白结构等需进一步丰富已上市人源化改型抗体已上市人源化改型抗体19971997年美国批准第一个人源化抗体药物上市，如年美国批准第一个人源化抗体药物上市，如今总数已达今总数已达1010个，占上市抗体药物总数的个，占上市
11、抗体药物总数的50%50%，如，如曲妥珠单抗曲妥珠单抗 ( (TrastuzumTrastuzum):):重组重组DNADNA人单克隆抗体人单克隆抗体, ,选择性作用于选择性作用于HERHER2 2 贝伐珠单抗贝伐珠单抗( (BevacizumabBevacizumab):):重组重组DNADNA人单克隆抗体人单克隆抗体, ,选择性作用于选择性作用于VEGF VEGF （4 43 3）小分子抗体）小分子抗体小分子抗体包括小分子抗体包括FabFab、FvFv或或ScFvScFv、单域抗体及最小、单域抗体及最小识别单位等几种。识别单位等几种。基因工程小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的基因工程小分子
12、抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的V V区片段，其相对分子质量仅为原抗体的区片段，其相对分子质量仅为原抗体的1/80-1/31/80-1/3。FvFvScFvScFv单区单区抗体抗体最小识别单位最小识别单位FabFab (1)Fab(1)Fab片段抗体：片段抗体：VH+CH1VH+CH1 (2)FV (2)FV抗体：抗体：VH+VL VH+VL (3) (3)单链抗体：单链抗体：VH-Linker-VLVH-Linker-VL (4) (4)单域抗体：单域抗体：VHVH或或VLVL小分子抗体有很多优点小分子抗体有很多优点: :可以用细菌或酵母菌发酵生产，成本低可以用细菌或酵母菌发酵生产，成本低; ;
13、分子小，穿透力强分子小，穿透力强; ;不含不含FcFc，没有，没有FcFc带来的效应带来的效应; ;在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出; ;易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或酶标抗体等。素或酶标抗体等。 由完整的轻链和由完整的轻链和FdFd组成，大小为完整分子的组成，大小为完整分子的1/31/3。 把把FabFab与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用下与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用下FabFab进进入质周腔，装配折叠后，它具有结合抗原的活性。入质周腔，装配折叠后，它具有结合抗原的活性。(
14、()Fab)Fab重组重组FabFab片断是单价的片断是单价的V VH H-C-CH H（FdFd）和轻链的）和轻链的V VL L-C-CL L两个片断由二硫键连接而成。它具有与抗体相同两个片断由二硫键连接而成。它具有与抗体相同的抗原结合活性，其特点是结构稳定，制作简便。的抗原结合活性，其特点是结构稳定，制作简便。细菌表达的细菌表达的FabFab与酶解与酶解IgIg后所获得的后所获得的FabFab具有相同具有相同的功能的功能。免疫球蛋白基因载体的构建H链表达载体L链表达载体共转染细胞共转染细胞Pr VH CH1 Pr VL CLFab 抗体分子的制备抗体分子的制备Fab antibody mo
15、lecule抗体分泌细胞VHVLCL-S-S-CH1Fab 抗体分子的制备抗体分子的制备FabFab抗体易于穿透血管壁和组织屏障进入病灶抗体易于穿透血管壁和组织屏障进入病灶无无FcFc段，减少了非特异反应和排斥反应段，减少了非特异反应和排斥反应无无ADCCADCC和细胞毒和细胞毒CDCCDC主要作为载体分子用于导向诊断和治疗主要作为载体分子用于导向诊断和治疗 FvFv、ScFvScFv的大小约为全分子的的大小约为全分子的1/61/6 FvFvScFvScFv连接肽连接肽()单链抗体单链抗体( (single chain antibodysingle chain antibody)） FvFvF
16、vFv是由抗体重，轻链的可变区基因是由抗体重，轻链的可变区基因(V(VH H、V VL L) )之间通之间通过一段编码连接肽基因，拼接后表达形成的重组过一段编码连接肽基因，拼接后表达形成的重组蛋白。是一种具有抗原结合能力的最小抗体片段，蛋白。是一种具有抗原结合能力的最小抗体片段，可在一些不需可在一些不需FcFc段效应功能的实际应用中开展研段效应功能的实际应用中开展研究和应用。究和应用。其优点是分子量小，易于穿透组织到达靶器官发其优点是分子量小，易于穿透组织到达靶器官发挥功效，易于构建和生产，但易于被清除。挥功效，易于构建和生产，但易于被清除。 分别构建载体分别构建载体L链表达载体链表达载体H链表达载体链表达载体共转染细胞共转染细胞Pr VH Pr VL Fv 二硫键稳定的二硫键稳定的Fv (disulfide-stabilized Fv,ds-Fv)小分子抗体的制备小分子抗体的制备ds-Fv抗体分泌细胞抗体分泌细胞VHVL-S-S-Fv小分子抗体的制备小分子抗体的制备disulfide-stabilized Fv,ds-Fv方法：方法：用基因工程方法，将抗体重链和轻链可用基因工程方法，
