《基因工程育种》PPT课件

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1、第八章第八章基因工程育种基因工程育种1第一节第一节 基因工程育种基因工程育种概述概述第二节第二节 重要的重要的工具酶工具酶第三节第三节 常用的载体常用的载体第四节第四节 基因工程育种基本过程基因工程育种基本过程第五节第五节 基因工程育种的应用基因工程育种的应用主要内容主要内容2第一节 基因工程育种概述3Cohen和和Boyverl973年年首首次次成成功功完完成成了了DNA分分子子的的 体体 外外 重重 组组 实实 验验 ， 宣宣 告告 基基 因因 工工 程程 (geneengineering)的的诞诞生生，也也为为微微生生物物育育种种带带来来了了一一场场革命。革命。基因工程育种基因工程育种广

2、义的基因工程育种包括所有利用广义的基因工程育种包括所有利用DNA重组技术重组技术将外源基因导入到微生物细胞将外源基因导入到微生物细胞，使后者获得前者的，使后者获得前者的某些某些优良性状优良性状或者利用后者作为表达场所来或者利用后者作为表达场所来生产目生产目的产物的产物。4基因工程育种的优势基因工程育种的优势与传统育种方法不同的是，基因工程育种可以突与传统育种方法不同的是，基因工程育种可以突破物种间的障碍，破物种间的障碍，实现真正意义上的远缘杂交实现真正意义上的远缘杂交。而且。而且这种远缘既可跨越微生物之间的种属障碍，还可实现这种远缘既可跨越微生物之间的种属障碍，还可实现动物、植物、微生物之间的

3、杂交。同时，利用基因工动物、植物、微生物之间的杂交。同时，利用基因工程方法，程方法，人们可以人们可以“随心所欲随心所欲”地进行自然演化过程地进行自然演化过程中不可能发生的新的遗传组合，创造全新的物种。中不可能发生的新的遗传组合，创造全新的物种。这这是一种自觉的、能像工程一样事先进行设计和控制的是一种自觉的、能像工程一样事先进行设计和控制的育种技术，是最新、最有前途的育种方法。育种技术，是最新、最有前途的育种方法。5第二节 重要的工具酶6工工具酶具酶 基基因因工工程程中中的的工工具具酶酶主主要要是是指指用用于于DNADNA和和RNARNA分分子子的的切切割割、连连接接、聚聚合合、修修饰饰、反反转

4、转录录等等有有关关的的各各种种酶酶系系统。统。7一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶(RE)(RE)是一类由细菌产生的能专一识别双链是一类由细菌产生的能专一识别双链DNA中的特中的特定碱基序列、并水解该点磷酸二酯键定碱基序列、并水解该点磷酸二酯键的核酸内切酶，的核酸内切酶，简称简称限制酶限制酶或或切割酶切割酶。 根据根据限制酶的限制酶的作用特性，一般分为三类：作用特性，一般分为三类： 、和和型，型， 其中常用的是其中常用的是型限制酶型限制酶。 8限制酶（限制酶（型）识别及切割位点型）识别及切割位点 特异识别及切割特异识别及切割4 4 8 8个个bpbp长度且具有长度且具有回文序列回文序列的

5、的DNADNA片断，主要产生片断，主要产生3 3种缺口：种缺口： 55粘性末端粘性末端 33粘性末端粘性末端 平头末端平头末端 回文序列回文序列 是指该部位的核苷酸序列呈是指该部位的核苷酸序列呈180180O O旋转对称旋转对称; ; 粘性末端粘性末端 是指经内切酶特异切割后产生的是指经内切酶特异切割后产生的55末端突出或末端突出或33末端突出的碱基序列，相互具有互补性末端突出的碱基序列，相互具有互补性。910其它特殊性质其它特殊性质的的型限制酶型限制酶同裂酶（同裂酶（异源同工酶异源同工酶）同尾酶同尾酶可变酶可变酶11同裂酶同裂酶 又称异源同工酶。指来源不同，但具有又称异源同工酶。指来源不同，

6、但具有相同的相同的识别序列识别序列。 在切割在切割DNADNA时，其时，其切割点切割点可以是可以是相同相同的，产生平的，产生平头末端，称为头末端，称为同识同切同识同切； 切割点切割点也可以是也可以是不同不同的，产生的，产生3 3或或55粘性末粘性末端，称为端，称为同识异切同识异切。 12同裂酶同裂酶同识同识同同切切13同裂酶同裂酶同识同识异异切切14同同尾尾酶酶 同尾酶同尾酶 指来源不同，但识别与切割顺序有一定的相关指来源不同，但识别与切割顺序有一定的相关性的一类酶。它们作用后性的一类酶。它们作用后产生相同产生相同的的粘性末端粘性末端。15可变酶可变酶可变酶可变酶 识别顺序中的一个或几个碱基是

7、可变的，识别顺序中的一个或几个碱基是可变的，并且识别顺序往往超过并且识别顺序往往超过6 6个碱基对。个碱基对。 如，如， BstBstpp，其识别顺序为，其识别顺序为GGTGGTN NACCACC。16 常用限制性核酸内切酶的特性微生物名称微生物名称酶名称酶名称识别顺序识别顺序同裂酶同裂酶同尾酶同尾酶Bacillus amyloliquefaciensH解淀粉芽孢杆菌解淀粉芽孢杆菌BamHGGATCCBstBgl MboBacillius globigil球芽孢杆菌球芽孢杆菌Bgl ACATCTEscherichia coliRY13大肠杆菌大肠杆菌EcoRGAATTCHaemophilus

8、influenzae流感嗜血菌流感嗜血菌HindAAGCTTHsuProvidencia stuartii164普罗威登细菌普罗威登细菌PstCTGCAGSalpStreptomyces albusSubspecies pathocidicus白色链球菌白色链球菌SalGTCGACAvaXho17二、二、DNADNA聚合酶聚合酶 （最常用的最常用的DNADNA聚合酶有以下聚合酶有以下4 4种种） DNA DNA聚合酶聚合酶 DNA DNA聚合酶聚合酶大片段大片段KlenowKlenow片段片段 Taq DNA Taq DNA聚合酶聚合酶 T T4 4 噬菌体噬菌体DNADNA聚合酶聚合酶18

9、DNA DNA聚合酶聚合酶 DNADNA聚合酶聚合酶（DNA pol DNA pol ） 是一个具有是一个具有3 3 种酶活性的多功能性酶。种酶活性的多功能性酶。包括：包括： 5 533DNA DNA 聚合酶活性聚合酶活性 5 533核酸外切酶活性核酸外切酶活性 3 355核酸外切酶活性核酸外切酶活性19 DNA pol DNA pol 应用应用 催化催化DNADNA缺口平移缺口平移反应，制备高比活性反应，制备高比活性DNADNA 探针；探针； 第二条第二条cDNAcDNA链的合成；链的合成； 对对DNA3DNA3突出末端进行标记；突出末端进行标记； DNA DNA序列分析。序列分析。20E.

10、 coli DNA pol 催化切口平移21 Klenow Klenow片段（片段（DNA pol.DNA pol.大片断）大片断）22 KlenowKlenow片段用途片段用途 补齐双链补齐双链DNADNA的的 3 3末端；末端； 用标记碱基补用标记碱基补 齐齐3 3末端末端 ； 在在cDNAcDNA克隆中，克隆中， 用于第二股链用于第二股链 的合成；的合成； DNA DNA序列分析。序列分析。23 Taq DNA pol Taq DNA pol（耐热（耐热DNADNA聚合酶）聚合酶） 作用特点作用特点1 1） Taq DNA pol Taq DNA pol催化催化DNADNA合成的最适温度

11、范围合成的最适温度范围 70 70 7575，2 2） 95 95以上高温，半小时不失活，以上高温，半小时不失活， 3 3） 最适合用于聚合酶链反应（最适合用于聚合酶链反应（PCRPCR）。）。 24三、逆转录酶三、逆转录酶 特点特点 逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以下逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以下3 3种酶种酶活性：活性： 以单链以单链RNA RNA 为模板，为模板， 催化合成催化合成cDNAcDNA单链单链 具有具有RNase H RNase H 活性，能水解活性，能水解RNA:DNARNA:DNA杂交链中的杂交链中的 RNA RNA 以以DNADNA为模板，催化合成为模板，催

12、化合成cDNAcDNA双链。双链。25 逆转录酶的应用：逆转录酶的应用： 将将mRNAmRNA逆转录成逆转录成cDNAcDNA，构建，构建cDNAcDNA文库；文库； 补平和标记补平和标记5 5- -末端突出的末端突出的DNADNA片段；片段； 代替代替KlenowKlenow酶用于酶用于DNADNA序列分析；序列分析； 制备杂交探针等。制备杂交探针等。26四、四、DNADNA连接酶连接酶(DNA ligase)(DNA ligase) DNADNA连连接接酶酶可可以以 催催化化带带有有粘粘性性末末端端或或平平头头末末端端的的双双链链DNADNA中中一一条条链链的的33OHOH与与另另一一条条

13、链链的的55POPO3 3H H2 2形形成成磷磷酸酸二二酯酯键键而而相相连连，从从而而构构成成一一条条完完整整的的DNADNA长长链。链。 DNADNA连接酶的用途连接酶的用途（1 1） 两个双链两个双链DNADNA片段连接起来片段连接起来 5- ACG AATTCGT-3 5- ACG AATTCGT-3 T T4 4DNADNA连接酶连接酶 5-ACGAATTCGT-3 5-ACGAATTCGT-3 3- TGCTTAA GCA-5 3-TGCTTAAGCA-5 3- TGCTTAA GCA-5 3-TGCTTAAGCA-5（2 2） 修补带有缺口的双链修补带有缺口的双链DNADNA分子

14、分子T4DNA连接酶连接酶27五、碱性磷酸酶五、碱性磷酸酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶(BAP) (BAP) 能够催化水解去除能够催化水解去除DNADNA或或RNA5-RNA5-端端的磷酸基团。的磷酸基团。用途用途 制备载体时，用碱性磷酸酶处理去除载体分子制备载体时，用碱性磷酸酶处理去除载体分子 55端磷酸基后，可防止载体自身环化连接，提高端磷酸基后，可防止载体自身环化连接，提高重组效率。重组效率。 用用3232P P标记标记5-5-端前，去除端前，去除5-P5-P，再通过激酶作用，再通过激酶作用把放射性核苷酸加到把放射性核苷酸加到5-5-端进行标记。端进行标记。28六、末端六、末端 （脱氧核苷酸）

15、转移酶（脱氧核苷酸）转移酶(TdT)(TdT) 作用作用 将将标标记记或或未未标标记记的的dNTPdNTP加加到到DNADNA的的3OH3OH末末端端；也也可可催催化化载载体体分分子子或或待待克克隆隆的的DNADNA片片断断上上加加上上互互补补的的同同聚聚尾尾，便便于于进进一步连接。一步连接。应用应用 探针标记探针标记 P32-.dGTPG32G32G32G32G32G32G32G32 在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接29重要的工具酶重要的工具酶工具酶工具酶 活性活性 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割识别特

16、异序列，切割DNA DNA T4 DNAT4 DNA连接酶连接酶 催化催化DNA5DNA5- -磷酸与磷酸与3 3- -羟基羟基 形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键 DNADNA聚合酶聚合酶 以以DNADNA为模板合成为模板合成DNA DNA 逆转录酶逆转录酶 以以RNARNA为模板合成为模板合成DNA DNA 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 切除末端磷酸切除末端磷酸T4T4多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶 催化核酸催化核酸5-5-羟基磷酸化羟基磷酸化末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶 催化催化3-3-端合成同聚体尾端合成同聚体尾30第三节第三节 常用的载体常用的载体31载体载体(vector)(vector) 是将外源是将外源DNA(DNA(目的目的DNA)DNA)片断引入宿主细胞片断引入宿主细胞的运载工具，其化学本质为的运载工具，其化学本质为DNA DNA 。 载体必须具备的基本条件载体必须具备的基本条件 载体的种类载体的种类 常用的载体常用的载体32一、载体必须具备的基本条件一、载体必须具备的基本条件 有自身的有自身的复制子复制子，能独立复制，能独立复制 具备多个限制酶的识别位点具备多个限制酶