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1、临床临床PCRPCR检验标本的采集、处检验标本的采集、处理、保存及核酸提取方法理、保存及核酸提取方法江西省肿瘤医院江西省肿瘤医院 陈文学陈文学检验误差的发生率检验误差的发生率n n1997年，一位意大利著名检验专家对急诊检验误差发生的种类和发生率进行了统计。结果显示，约有68.2%的检验误差发生在检验前期，而来自检验中期和检验后期的误差率分别为13.3%和18.5%。n n2007年，这位专家又进行了类似的统计，结果显示，检验前期的误差发生率仍高达61.9%正确采集、运送、保存临床标本正确采集、运送、保存临床标本的重要性的重要性n n质量保证关键性环节质量保证关键性环节n n解决涉及实验室检验
2、的医患纠纷的方解决涉及实验室检验的医患纠纷的方法之一法之一核酸提取的重要性核酸提取的重要性n n核酸提取是临床PCR检验最为关键的部分n n核酸提取的成败关系到临床PCR检验的正确与否n n临床PCR检验操作中最易出问题的环节标本采集标本采集n n标本采集时间对扩增检测结果的影响（过早或（过早或过晚都可能会出现假阴性结果）过晚都可能会出现假阴性结果） n n标本采集部位的准备（适度消毒）（适度消毒） n n标本的类型和采集量 （衣原体（衣原体 上皮细胞）上皮细胞）n n采样质量的评价（评价方法：肉眼观察、显微镜下观察和化（评价方法：肉眼观察、显微镜下观察和化学分析）学分析） n n采样及运输容
3、器（一次性无菌器材（一次性无菌器材, ,防腐剂防腐剂, ,抗凝剂）抗凝剂） n n标本采集中的防污染（一次性无菌容器（一次性无菌容器，防止混入操作防止混入操作者头发，表皮等，如玻璃容器要高压灭菌）者头发，表皮等，如玻璃容器要高压灭菌） 标本运送标本运送 n n样本一经采集，则应尽可能快的送至检测实验室。n n样本中如加入了适当的稳定剂,如用于RNA测定加入GITC的血清(浆)样本和用于DNA测定的EDTA抗凝血等,则可在室温下运送或邮寄。n n实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种临床样本的运送条件作出相应的规定。临床标本的处理和保存临床标本的处理和保存n n血清（浆）血清（浆）n n全血全血n
4、 n外周血单个核细胞外周血单个核细胞n n痰痰n n棉拭子棉拭子n n脓液脓液n n体液体液n n乳汁乳汁n n组织组织血清（浆）血清（浆）n nDNA测定，可按照一般的血清标本处理程序，对测定影响不大。n nRNA测定，标本的获取和保存方式对测定结果，可能有决定性影响。最好是使用EDTA抗凝( (严禁使用肝素，因其对严禁使用肝素，因其对PCRPCR扩增有抑制，扩增有抑制，且很难在核酸提取过程中完全去除且很难在核酸提取过程中完全去除) )全血标本，抗凝后6小时内分离血浆，如使用血清标本，则需尽快(2小时内)分离血清，标本的短期（12周）保存可在-20下，较长期保存应在-70下。 全血全血n n
5、以全血作为待测标本时,必须注意抗凝剂的选择,一般使用EDTA-Na2或枸椽酸钠,不可使用肝素。n n全血样本如用于DNA提取检测,可4下短期保存,如用于RNA检测，则应在取血后，尽快提取RNA 。外周血单个核细胞外周血单个核细胞 n n外周血单个核细胞可从抗凝全血制备，主要有两条途径，一是使用淋巴细胞分离液分离制备；二是使用红细胞裂解液,裂解全血中的红细胞,经生理盐水数次洗涤,即可得到单个核细胞。n n外周血单个核细胞如暂不提取核酸,可保存于-70下.痰痰n n痰痰属属于于分分泌泌物物, ,临临床床上上常常用用作作为为结结核核杆杆菌菌DNADNA测测定定标本。标本。n n痰痰标标本本中中含含有
6、有大大量量粘粘蛋蛋白白和和杂杂质质, ,故故在在核核酸酸提提取取时时, ,需需对对样样本本进进行行初初步步处处理理，即即用用1 1 mol/L mol/L NaOHNaOH或或变变性剂液化。性剂液化。n n如如用用于于非非结结核核杆杆菌菌如如肺肺炎炎支支原原体体的的PCRPCR检检测测，痰痰标标本本只只能能室室温温悬悬浮浮于于生生理理盐盐水水中中，充充分分振振荡荡混混匀匀，促促使使大大块块粘粘状状物物下下沉沉，取取上上清清离离心心，所所得得到到的的沉沉淀物即可用于核酸提取。淀物即可用于核酸提取。 n n液液化化标标本本如如不不立立即即用用于于核核酸酸提提取取, ,可可保保存存于于-70-70下
7、。下。痰标本处理的基本模式痰标本处理的基本模式n n通用模式n n简单模式痰标本处理通用模式痰标本处理通用模式（1 1）通用标本处理（）通用标本处理（Universal sample processing, Universal sample processing, USPUSP）溶液：）溶液： 4-6 mol/L4-6 mol/L盐酸胍（盐酸胍（GuHClGuHCl） 50 50 mmolmmol/L /L Tris-HClTris-HCl, pH7.5, pH7.5 25 25 mmolmmol/L EDTA/L EDTA 0.5% 0.5%十二烷基肌酸钠十二烷基肌酸钠十二烷基肌酸钠十二烷基
8、肌酸钠（SarkosylSarkosyl ） 0.10.2 mol/L -0.10.2 mol/L -巯基乙醇。巯基乙醇。（2 2）0.05%Tween 800.05%Tween 80。（3 3）10%Chelex-100( 10%Chelex-100( 含含0.03% Triton X-1000.03% Triton X-100和和0.3% 0.3% TweenTween 20) 20)一定体积的痰1.5倍体积的USP溶液,震荡30-40s10-15ml蒸馏水，室温放置5-10min5000g室温离心10-15min，弃上清500ul无菌0.05%Tween80溶解或重悬20000g室温离心
9、10-15min，弃上清加入5倍10%chelex-100，混匀，90温育40min20000g室温离心5min取5ul用于PCR扩增痰标本处理简单模式痰标本处理简单模式 n n试剂：（试剂：（1 1）裂解液）裂解液: :含终浓度含终浓度0.1 mol/L 0.1 mol/L NaOHNaOH、50g50g蛋白蛋白酶酶K K和和0.05% Triton X-1000.05% Triton X-10050ul痰6000g离心10分钟，弃上清加入裂解液50ul，60温育30min90温育30min加入Tris-HCl中和以上反应混合物取5ul用于PCR检测痰标本处理中要注意的问题痰标本处理中要注意
10、的问题n n痰标本在没有加入内标以控制假阴性的情况下，不能采用异硫氰酸胍盐（GuSCN）方法提取。采用这种方法提取，有可能会在提取过程中，出现一种可修饰DNA的酶，在最后一步提取中，与核酸一起洗提出来，从而抑制其后的扩增。n n在PCR主反应混合液中，加入-酪蛋白（alpha-casein）、白蛋白等，有防止此类抑制物产生的效果。 棉拭子棉拭子n n在使用PCR方法检测性病病原体时,临床标本一般为棉拭子,可将棉拭子置于适量生理盐水中,充分震荡洗涤后,室温静置510分钟,待大块状物下沉后,取上清立即离心,其后的沉淀即可用于DNA提取。n n如不立即用于核酸提取,则需保存于-70下.脓液脓液n n
11、脓脓液液的的处处理理依依情情况况而而定定, ,如如用用于于分分枝枝杆杆菌菌( (如如结结核核杆杆菌菌) )核核酸酸测测定定的的标标本本, ,粘粘稠稠的的脓脓液液可可采采用用痰痰标标本本的的处处理理模模式式，先先进进行行液液化化，再再离离心心取取沉沉淀淀提提取取DNADNA；水水样样的的脓脓液液则则直直接接离离心心, ,沉沉淀淀用用生生理理盐水洗盐水洗2 23 3次后次后, ,即可用于即可用于DNADNA提取。提取。n n对对于于用用于于非非分分枝枝杆杆菌菌测测定定的的脓脓液液标标本本, ,如如过过于于粘粘稠稠, ,则则加加入入适适量量生生理理盐盐水水, ,充充分分振振荡荡后后, ,静静置置,
12、,取取上上清清立立即即离离心心, ,沉沉淀淀用用于于DNADNA提提取取; ;如如为为水水样样, ,则则按上述直接离心取沉淀即可。按上述直接离心取沉淀即可。n n沉淀标本的保存条件同样为沉淀标本的保存条件同样为-70-70。体液体液n临床体液标本包括胸水,腹水,脑脊液,尿液等,可按水样标本的方式离心取沉淀后,提取核酸。沉淀样本的保存同上。乳汁乳汁n n 乳汁有时也可作为标本，如乳汁中HBV DNA、HCV RNA、结核分枝杆菌和布鲁氏菌等的PCR检测。 乳汁中分枝杆菌乳汁中分枝杆菌DNA的提取的提取n n试剂准备 裂解液：50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA, 2
13、% Triton X-100, 4 mol/L 异硫氰酸胍盐（GITC）, 0.3 mol/L 醋酸钠。 玻璃珠：（直径：425-600um）乳汁标本离心6000rpm，5min，弃上清脂质和沉淀用750ul裂解液重悬重悬液移入含100mg玻璃珠离心管搅拌煮沸5min，离心14000rpm，3min650ul上清转移到另一离心管中，等体积异丙醇沉淀70%乙醇洗涤沉淀，干燥50ul Tris-EDTA溶解沉淀即可用于PCR扩增组织组织 n n组组织织有有新新鲜鲜组组织织块块和和石石蜡蜡切切片片。新新鲜鲜组组织织块块的的处处理理步步聚聚首首先先用用生生理理盐盐水水洗洗两两次次, ,然然后后将将其其
14、捣捣碎碎或或切切碎碎，加加入入生生理理盐盐水水后后剧剧烈烈震震荡荡混混匀匀, ,离离心心，弃弃上上清清，再再用用蛋蛋白白酶酶K K消消化化后后提提取核酸。取核酸。n n新新鲜鲜组组织织最最好好是是保保存存于于50%50%乙乙醇醇中中, ,具具体体作作法法是是，先先用用生生理理盐盐水水将将组组织织洗洗一一次次, ,切切成成宽宽度度小小于于1cm1cm的的小小片片, ,加加入入适适量量的的生生理理盐盐水水, ,然然后后, ,边边摇摇边边加加入入无无水水乙乙醇醇至至终终浓浓度度为为50%.50%.这这样固定的组织标本室温下可保存数日样固定的组织标本室温下可保存数日,4,4可保存可保存6 6年。年。n
15、 n石石蜡蜡切切片片用用于于核核酸酸提提取取, ,需需先先用用辛辛烷烷或或二二甲甲苯苯脱脱蜡蜡, ,再再用用蛋蛋白酶白酶K K消化后即可进行消化后即可进行DNADNA提取。提取。临床标本的滤纸上保存临床标本的滤纸上保存n n临床标本置于经过处理的滤纸片上，如靶核酸为DNA，可室温保存数月至数年，如靶核酸为RNA，则可稳定数周。 n n保存在滤纸上的标本，保存时间长，还可因为标本中的PCR抑制物如血红蛋白、酶、免疫球蛋白等吸附于滤纸上，而不对后面的扩增检测造成影响。 n n不管是全血、血清（浆）。还是尿液、粪便、分泌物等均可此种方法。 临床标本中临床标本中PCR反应抑制物反应抑制物n n内源性的
16、 :免疫球蛋白、蛋白酶、血红素及其代谢产物、白细胞内的乳铁蛋白、肌红蛋白、脂类、粘蛋白、尿素、离子、胆盐、多糖等。 n n外源性的 :如肝素抗凝剂、纤维素和硝酸纤维素、过度UV照射后的矿物油、手套滑石粉、标本容器或采样器材上含有的抑制物。 肝素的作用机理肝素的作用机理 n n肝素对肝素对MLVMLV逆转录酶和逆转录酶和TAQ DNATAQ DNA聚合酶均很强的聚合酶均很强的抑制作用，如果临床标本为肝素抗凝，则在核酸抑制作用，如果临床标本为肝素抗凝，则在核酸纯化过程中，纯化过程中，标本中的肝素可结合于标本中的肝素可结合于DNADNA和和RNARNA上上，尽管肝素和核酸本身都带正电荷。，尽管肝素和核酸本身都带正电荷。n n对标本进行煮沸、凝胶过滤、酸碱处理后凝胶过对标本进行煮沸、凝胶过滤、酸碱处理后凝胶过滤、反复乙醇沉淀等均不能去除肝素的这种干扰滤、反复乙醇沉淀等均不能去除肝素的这种干扰作用。作用。肝素的作用机理肝素的作用机理n n每每gg核酸标本中加入核酸标本中加入0.1U0.1U的肝素的肝素, ,即可即可100%100%的抑的抑制酶活性。制酶活性。n n在标本中加入肝素酶在标本中加入肝
