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1、细胞培养细胞培养1 1一一 原代培养（略）原代培养（略）2 2二二. 传传 代代 培培 养养 准备及注意事项准备及注意事项 换换 液液 传传 代代 冻冻 存存 复复 苏苏 MTT3 3准备事项准备事项1.紫外灯照射细胞室紫外灯照射细胞室30分钟分钟,风机运行风机运行10分分钟后方可进入实验室钟后方可进入实验室.2.穿专用的口罩穿专用的口罩,帽子帽子,拖鞋拖鞋,工作衣等工作衣等.3.带手套带手套,并用酒精擦拭之并用酒精擦拭之.4.准备好实验必需用品准备好实验必需用品.5.超净工作台内操作前用酒精棉球擦拭台面超净工作台内操作前用酒精棉球擦拭台面.6.超净工作台内操作完成后，超净工作台内操作完成后，
2、要用酒精棉球擦拭台面要用酒精棉球擦拭台面,除了酒精灯除了酒精灯,镊子镊子,试管架等试管架等物品外物品外,其他都要拿出工作台外其他都要拿出工作台外.紫外灯照射紫外灯照射30分钟分钟.4 4换液换液1.把细胞培养瓶从培养箱中拿出把细胞培养瓶从培养箱中拿出, 拧紧盖子拧紧盖子;2.观察瓶内培养基的颜色观察瓶内培养基的颜色, 是否浑浊等是否浑浊等; 放在倒置显微镜下观察细胞生长状况。放在倒置显微镜下观察细胞生长状况。3.放入超净工作台内放入超净工作台内,点燃酒精灯点燃酒精灯,拿培养瓶拿培养瓶口在酒精灯火焰上转两圈以上口在酒精灯火焰上转两圈以上,至少三秒至少三秒.4.取下盖子取下盖子,烧瓶口烧瓶口;倒掉
3、培养基倒掉培养基,烧瓶口烧瓶口;5.拿出拿出PBS液瓶子液瓶子,烧瓶口和镊子烧瓶口和镊子;用镊子将用镊子将塞子取出塞子取出,烧瓶口（至少烧瓶口（至少10圈）。圈）。5 56.6.用吸管吸取用吸管吸取用吸管吸取用吸管吸取3ml3ml的的的的PBSPBS，打入培养瓶内。烧培养瓶口，打入培养瓶内。烧培养瓶口，打入培养瓶内。烧培养瓶口，打入培养瓶内。烧培养瓶口， 来回晃动来回晃动来回晃动来回晃动PBS100PBS100次后到掉次后到掉次后到掉次后到掉PBSPBS。重复此操作一次。重复此操作一次。重复此操作一次。重复此操作一次。7.7.拿出培养基瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子取出，拿出培养基瓶子，烧瓶
4、口和镊子；用镊子将塞子取出，拿出培养基瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子取出，拿出培养基瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子取出， 烧瓶口（至少烧瓶口（至少烧瓶口（至少烧瓶口（至少1010圈）。圈）。圈）。圈）。8.8.用吸管吸取用吸管吸取用吸管吸取用吸管吸取5ml-8ml5ml-8ml的培养基打入培养瓶内，烧瓶口，的培养基打入培养瓶内，烧瓶口，的培养基打入培养瓶内，烧瓶口，的培养基打入培养瓶内，烧瓶口， 镊子和盖子；镊子和盖子；镊子和盖子；镊子和盖子；9.9.盖上盖子，倒置显微镜下观察，之后标明名称和日期，盖上盖子，倒置显微镜下观察，之后标明名称和日期，盖上盖子，倒置显微镜下观察，之后标明名称和日
5、期，盖上盖子，倒置显微镜下观察，之后标明名称和日期， 酒精棉球擦瓶口和瓶身，放入培养箱内即可。酒精棉球擦瓶口和瓶身，放入培养箱内即可。酒精棉球擦瓶口和瓶身，放入培养箱内即可。酒精棉球擦瓶口和瓶身，放入培养箱内即可。 注意：注意：1.1.打开培养箱时尽量不要说话；打开培养箱时尽量不要说话；打开培养箱时尽量不要说话；打开培养箱时尽量不要说话；2.2.步骤步骤步骤步骤9 9中培养瓶放入培养箱时，应把盖子拧开少许。中培养瓶放入培养箱时，应把盖子拧开少许。中培养瓶放入培养箱时，应把盖子拧开少许。中培养瓶放入培养箱时，应把盖子拧开少许。 6 6传代传代1.把细胞培养瓶从培养箱中拿出，拧紧盖子；把细胞培养瓶
6、从培养箱中拿出，拧紧盖子；2.观察瓶内培养基的颜色，是否浑浊等；放在观察瓶内培养基的颜色，是否浑浊等；放在 倒置显微镜下观察细胞生长状况。倒置显微镜下观察细胞生长状况。3.放入超净工作台内，点燃酒精灯，拿培养瓶放入超净工作台内，点燃酒精灯，拿培养瓶 口在酒精灯火焰上转两圈以上，至少三秒。口在酒精灯火焰上转两圈以上，至少三秒。4.取下盖子，烧瓶口；倒掉培养基，烧瓶口；取下盖子，烧瓶口；倒掉培养基，烧瓶口；5.拿出拿出PBS瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞 子取出，烧瓶口（至少子取出，烧瓶口（至少10圈）。圈）。7 7 6. 6.用吸管吸取用吸管吸取用吸管吸取用吸管吸取
7、3ml3ml的的的的PBSPBS，打入培养瓶内。烧培养，打入培养瓶内。烧培养，打入培养瓶内。烧培养，打入培养瓶内。烧培养 瓶口，来回晃动瓶口，来回晃动瓶口，来回晃动瓶口，来回晃动PBS100PBS100次后到掉次后到掉次后到掉次后到掉PBSPBS。重复此。重复此。重复此。重复此 操作一次。操作一次。操作一次。操作一次。7.7.拿出胰酶瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子取拿出胰酶瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子取拿出胰酶瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子取拿出胰酶瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子取 出，烧瓶口（至少出，烧瓶口（至少出，烧瓶口（至少出，烧瓶口（至少1010圈）。圈）。圈）。圈）。8.8
8、.用吸管吸取用吸管吸取用吸管吸取用吸管吸取1ml1ml的胰酶，打入培养瓶内，烧培养的胰酶，打入培养瓶内，烧培养的胰酶，打入培养瓶内，烧培养的胰酶，打入培养瓶内，烧培养 瓶口和盖子，盖上盖子；瓶口和盖子，盖上盖子；瓶口和盖子，盖上盖子；瓶口和盖子，盖上盖子；9.9.拿出工作台外，在倒置显微镜下观察细胞，然后拿出工作台外，在倒置显微镜下观察细胞，然后拿出工作台外，在倒置显微镜下观察细胞，然后拿出工作台外，在倒置显微镜下观察细胞，然后 用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培养箱内；用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培养箱内；用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培养箱内；用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培养箱内；5 5分钟分钟
9、分钟分钟 后取出；后取出；后取出；后取出；8 810.在倒置显微镜下观察细胞的消化情况。若在倒置显微镜下观察细胞的消化情况。若 细胞变成单个圆形，则可进行传代。细胞变成单个圆形，则可进行传代。11.拿到工作台内，烧瓶口，取下盖子，烧瓶拿到工作台内，烧瓶口，取下盖子，烧瓶 口。用吸管吸出胰酶，烧瓶口。口。用吸管吸出胰酶，烧瓶口。12.拿出培养基瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子拿出培养基瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子 将塞子取出，烧瓶口（至少将塞子取出，烧瓶口（至少10圈）。圈）。13.用吸管吸取用吸管吸取5ml的培养基打入培养瓶内，的培养基打入培养瓶内， 用吸管吹打成单个细胞悬液。计数，分装用吸管吹打成单
10、个细胞悬液。计数，分装 即可。即可。9 9冻存冻存1.把细胞培养瓶从培养箱中拿出，拧紧盖子；把细胞培养瓶从培养箱中拿出，拧紧盖子；2.观察瓶内培养基的颜色，是否浑浊等；放在观察瓶内培养基的颜色，是否浑浊等；放在倒置显微镜下观察细胞生长状况。倒置显微镜下观察细胞生长状况。3.放入超净工作台内，点燃酒精灯，拿培养瓶放入超净工作台内，点燃酒精灯，拿培养瓶口在酒精灯火焰上转两圈以上，至少三秒。口在酒精灯火焰上转两圈以上，至少三秒。4.取下盖子，烧瓶口；倒掉培养基，烧瓶口；取下盖子，烧瓶口；倒掉培养基，烧瓶口；5.拿出拿出PBS瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子取出，烧瓶口（
11、至少子取出，烧瓶口（至少10圈）。圈）。10106. 6. 用吸管吸取用吸管吸取用吸管吸取用吸管吸取3ml3ml的的的的PBSPBS，打入培养瓶内。烧培养，打入培养瓶内。烧培养，打入培养瓶内。烧培养，打入培养瓶内。烧培养瓶口，来回晃动瓶口，来回晃动瓶口，来回晃动瓶口，来回晃动PBS100PBS100次后到掉次后到掉次后到掉次后到掉PBSPBS。重复此。重复此。重复此。重复此操作一次。操作一次。操作一次。操作一次。7. 7. 拿出胰酶瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子拿出胰酶瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子拿出胰酶瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子拿出胰酶瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子取出，烧瓶口
12、（至少取出，烧瓶口（至少取出，烧瓶口（至少取出，烧瓶口（至少1010圈）。圈）。圈）。圈）。8. 8. 用吸管吸取用吸管吸取用吸管吸取用吸管吸取1ml1ml的胰酶，打入培养瓶内，烧培养的胰酶，打入培养瓶内，烧培养的胰酶，打入培养瓶内，烧培养的胰酶，打入培养瓶内，烧培养瓶口和盖子，盖上盖子；瓶口和盖子，盖上盖子；瓶口和盖子，盖上盖子；瓶口和盖子，盖上盖子；9. 9. 拿出工作台外，在倒置显微镜下观察细胞，然拿出工作台外，在倒置显微镜下观察细胞，然拿出工作台外，在倒置显微镜下观察细胞，然拿出工作台外，在倒置显微镜下观察细胞，然后用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培养箱内；后用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培
13、养箱内；后用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培养箱内；后用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培养箱内；5 5分钟后取出；分钟后取出；分钟后取出；分钟后取出；10. 10. 在倒置显微镜下观察细胞的消化情况。若细胞在倒置显微镜下观察细胞的消化情况。若细胞在倒置显微镜下观察细胞的消化情况。若细胞在倒置显微镜下观察细胞的消化情况。若细胞变成单个圆形，则可进行传代。变成单个圆形，则可进行传代。变成单个圆形，则可进行传代。变成单个圆形，则可进行传代。111111.11.拿到工作台内，烧瓶口，取下盖子，烧瓶拿到工作台内，烧瓶口，取下盖子，烧瓶拿到工作台内，烧瓶口，取下盖子，烧瓶拿到工作台内，烧瓶口，取下盖子，烧瓶 口。
14、用吸管吸出胰酶，烧瓶口。口。用吸管吸出胰酶，烧瓶口。口。用吸管吸出胰酶，烧瓶口。口。用吸管吸出胰酶，烧瓶口。12.12.拿出培养基瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子拿出培养基瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子拿出培养基瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子拿出培养基瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子 将塞子取出，烧瓶口（至少将塞子取出，烧瓶口（至少将塞子取出，烧瓶口（至少将塞子取出，烧瓶口（至少1010圈）。圈）。圈）。圈）。13.13.用吸管吸取用吸管吸取用吸管吸取用吸管吸取5ml5ml的培养基打入培养瓶内，用吸管的培养基打入培养瓶内，用吸管的培养基打入培养瓶内，用吸管的培养基打入培养瓶内，用吸管 吹打成单个细胞悬液。吹打成单
15、个细胞悬液。吹打成单个细胞悬液。吹打成单个细胞悬液。14.14.用吸管将细胞悬液移至用吸管将细胞悬液移至用吸管将细胞悬液移至用吸管将细胞悬液移至5ml5ml离心管中，盖上盖离心管中，盖上盖离心管中，盖上盖离心管中，盖上盖 子，在离心机内离心，子，在离心机内离心，子，在离心机内离心，子，在离心机内离心，15001500转转转转/ /分钟，时间为分钟，时间为分钟，时间为分钟，时间为1515 分钟。分钟。分钟。分钟。15.15.离心结束后，拿至工作台内，烧离心管口。去掉离心结束后，拿至工作台内，烧离心管口。去掉离心结束后，拿至工作台内，烧离心管口。去掉离心结束后，拿至工作台内，烧离心管口。去掉 塞子
16、，烧管口。塞子，烧管口。塞子，烧管口。塞子，烧管口。121216.16.弃上清液，加冻存液弃上清液，加冻存液弃上清液，加冻存液弃上清液，加冻存液2ml 2ml 吹打，使细胞均匀混在吹打，使细胞均匀混在吹打，使细胞均匀混在吹打，使细胞均匀混在冻存液中，再加冻存液中，再加冻存液中，再加冻存液中，再加3ml3ml冻存液，用吸管吸出打入多冻存液，用吸管吸出打入多冻存液，用吸管吸出打入多冻存液，用吸管吸出打入多个冻存管中，每管个冻存管中，每管个冻存管中，每管个冻存管中，每管1.5ml1.5ml。17.17.盖上盖子，用封口膜封好盖上盖子，用封口膜封好盖上盖子，用封口膜封好盖上盖子，用封口膜封好, ,标上细胞名称和日期标上细胞名称和日期标上细胞名称和日期标上细胞名称和日期 . .18.18.冻存方式：冻存方式：冻存方式：冻存方式：4 43030分钟，分钟，分钟，分钟，-20-201515分钟，分钟，分钟，分钟，-80-806060分钟，最后转移到液氮罐内。分钟，最后转移到液氮罐内。分钟，最后转移到液氮罐内。分钟，最后转移到液氮罐内。注意：注意：冻存管移动时要夹在冰块中间。冻存管移动时要夹在冰块中间
