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1、2007-10-111结核菌培养结核菌培养酸性罗氏培养管上结核分枝杆菌菌落结核分枝杆菌显微镜下形态结核分枝杆菌显微镜下形态2007-10-114培养目的：一：增加分枝杆菌生产率，早期生长、早期诊断；二：提高阳性率，使少数细菌亦能生长出来；三：进一步进行药敏试验和菌型鉴定。2007-10-115培养培养敏感性、特异性更强敏感性、特异性更强,理论上理论上10-10010-100条菌条菌/ /毫升可毫升可检出阳性；检出阳性；获得分枝杆菌培养物，是进一步检测的基础获得分枝杆菌培养物，是进一步检测的基础需时长需时长, ,根据接种量的大小，一般根据接种量的大小，一般2-82-8周才能得到肉周才能得到肉眼可
2、见菌落。眼可见菌落。需要培养箱、涡旋振荡器、培养基凝固器等设备需要培养箱、涡旋振荡器、培养基凝固器等设备相对涂片技术要求较高相对涂片技术要求较高成本是直接涂片法的成本是直接涂片法的7-87-8倍。倍。据2001版伯杰金氏手册，结核杆菌现属于新成立的放线菌门、放线菌纲、放线菌亚纲、放线菌目、棒杆菌亚目、分支杆菌科 结核分枝杆菌（结核分枝杆菌（MTb）结核病的病原体结核病的病原体18821882年郭霍（年郭霍（Robert KochRobert Koch）发现）发现繁殖时有分支生长的趋势，故称分支杆繁殖时有分支生长的趋势，故称分支杆菌菌具有抗酸性具有抗酸性,又称抗酸杆菌又称抗酸杆菌,用抗酸染色用抗
3、酸染色的方法检查分枝杆菌的方法检查分枝杆菌分枝杆菌有致病性和非致病性两大类分枝杆菌有致病性和非致病性两大类主要引起肺結核主要引起肺結核的的致病性分枝杆菌有致病性分枝杆菌有人人型型、牛牛型型、非洲非洲、田鼠分枝田鼠分枝杆杆菌菌 二、痰涂片镜检标准化操作二、痰涂片镜检标准化操作 结核杆菌（结核杆菌（MTb）形态）形态(杆菌型杆菌型)结核分支杆菌是专性需氧菌，无鞭毛、荚膜，无结核分支杆菌是专性需氧菌，无鞭毛、荚膜，无运动能力；运动能力；结核杆菌在痰液中多为单个存在或形成分枝，有结核杆菌在痰液中多为单个存在或形成分枝，有时呈时呈V、Y、人字形排列，痰菌量多时可排列为束、人字形排列，痰菌量多时可排列为束
4、状或集聚成团。状或集聚成团。结核分枝杆菌由细胞壁、细胞膜、细胞质、核物结核分枝杆菌由细胞壁、细胞膜、细胞质、核物质组成。质组成。菌体内可有菌体内可有2-5个或更多的小圆形易染颗粒，异染个或更多的小圆形易染颗粒，异染颗粒可超过菌体横径。颗粒可超过菌体横径。 显微镜下结核分支杆菌形态结核分枝杆菌显微镜下形态结核分枝杆菌显微镜下形态2007-10-1111结核分枝杆菌生长特性：结核分枝杆菌生长特性： 缓慢：在一般培养基上分裂一代需要缓慢：在一般培养基上分裂一代需要1010多小时，多小时，一般一般10-3010-30天肉眼可见菌落生长。天肉眼可见菌落生长。 菌落形态（罗氏培养基）：粗糙、凸起、致密，菌
5、落形态（罗氏培养基）：粗糙、凸起、致密，有表面皱折，呈颗粒、结节或菜花样，浅黄色或有表面皱折，呈颗粒、结节或菜花样，浅黄色或米色，不透明。米色，不透明。2007-10-11122007-10-1113基本步骤：基本步骤：q 制备培养基制备培养基q 标本前处理（去污染）标本前处理（去污染）q 接种接种q 孵育孵育q 报告结果报告结果2007-10-1114 酸性罗氏酸性罗氏（Lowenstein-Jensen）培养基培养基 天门冬素天门冬素 3.6g 3.6g 或谷氨酸钠（纯度或谷氨酸钠（纯度99%99%以上）以上）7.2g7.2gKHKH2 2POPO4 4 14.0g 14.0gMgSO4.
6、7HMgSO4.7H2 2O 0.24gO 0.24g枸橼酸镁枸橼酸镁 0.6g0.6g丙三醇丙三醇 12ml12ml蒸馏水蒸馏水 600ml600ml新鲜鸡卵液新鲜鸡卵液 1000ml1000ml2%2%孔雀绿孔雀绿 20ml20ml一、一、培培 养养 基基2007-10-1116原理：原理：分枝杆菌对酸碱有相对强的耐受力。分枝杆菌对酸碱有相对强的耐受力。目的：目的：液化标本、去除杂菌、分离出分枝杆菌液化标本、去除杂菌、分离出分枝杆菌原则：原则： - - 尽可能杀灭标本中的杂菌尽可能杀灭标本中的杂菌 - - 尽可能保存标本中的分枝杆菌尽可能保存标本中的分枝杆菌二、标本前处理二、标本前处理20
7、07-10-1117 操作操作 痰标本痰标本痰标本痰标本1 1 1 12 2 2 2倍倍倍倍4% NaOH4% NaOH4% NaOH4% NaOH振荡匀化振荡匀化静置静置15分钟分钟2007-10-1118 3737竖直培养竖直培养8 8周周均匀接种均匀接种0.1ml,2支支/标本标本斜面向上，斜面向上，3737水平放置水平放置24小时小时三、接种和孵育三、接种和孵育2007-10-1119接种后第接种后第3 3、7 7天各观察一次菌落生长情天各观察一次菌落生长情况况此后每周观察一次，直至满此后每周观察一次，直至满8 8周周记录菌落生长及污染情况。记录菌落生长及污染情况。四、结果的观察与报告
8、四、结果的观察与报告2007-10-1120报报 告告 方方 式式分枝杆菌培养阴性：分枝杆菌培养阴性： 斜面无菌落生长斜面无菌落生长菌落生长不足斜面面积菌落生长不足斜面面积1/41/4者，报实际菌落数。者，报实际菌落数。分枝杆菌培养阳性分枝杆菌培养阳性（1+1+）： 菌落生长占斜面面积的菌落生长占斜面面积的1/41/4分枝杆菌培养阳性分枝杆菌培养阳性（2+2+）： 菌落生长占斜面面积的菌落生长占斜面面积的1/21/2分枝杆菌培养阳性分枝杆菌培养阳性（3+3+）： 菌落生长占斜面面积的菌落生长占斜面面积的3/43/4分枝杆菌培养阳性分枝杆菌培养阳性（4+4+）： 菌落生长布满整个斜面菌落生长布满
9、整个斜面2007-10-1121 分离培养流程分离培养流程: :涡旋振荡涡旋振荡2-32-3次次痰标本中加入痰标本中加入1-21-2倍体积倍体积4%NaOH4%NaOH分别接种分别接种0.1ml0.1ml前处理液至前处理液至2 2只培养基斜面只培养基斜面接种后接种后3 3天、天、7 7天天观察，此后每周观察，此后每周观察一次观察一次置置3737o oC C温温箱培养箱培养有菌落生长需经有菌落生长需经抗酸染色确认，抗酸染色确认，至第至第8 8周无菌落周无菌落生长报告阴性生长报告阴性室温静置室温静置1515分钟分钟4 43 32 25 56 67 71 12007-10-1122可能原因可能原因解
10、决方法解决方法标本保存不当标本保存不当( (时间、时间、温度）温度）涂片后标本于冰箱保存，涂片后标本于冰箱保存，2424小时内培养。小时内培养。标本选择不当标本选择不当选择标本中脓样、干酪样选择标本中脓样、干酪样可疑部分可疑部分过处理（时间、浓度过处理（时间、浓度) ) 4 4NaOHNaOH，1 12 2倍体积，倍体积，2020分钟分钟接种量太小接种量太小每管接种每管接种0.10.1毫升毫升温箱温度不当温箱温度不当温箱内置温度计，每日监温箱内置温度计，每日监测温度。测温度。涂阳培阴率过高？涂阳培阴率过高？2007-10-1123可能原因可能原因解决方法解决方法标本保存不当标本保存不当( (时
11、间、温度）时间、温度）涂片留取后涂片留取后2424小时内培养，不能及时小时内培养，不能及时培养的培养的4 4o oC C冰箱保存。冰箱保存。前处理不充分前处理不充分4 4，1 12 2倍，充分混旋，倍，充分混旋，2020分钟。分钟。材料灭菌不佳材料灭菌不佳接种用吸管需高压灭菌。接种用吸管需高压灭菌。操作不当操作不当培训，严格按操作规程操作。培训，严格按操作规程操作。培养基因素培养基因素统一供应，统一供应，4 4o oC C直立保存，直立保存，1 1个月内使个月内使用用污染率过高？污染率过高？2007-10-1124菌种保存原则：一个有利的休眠环境，干燥、低温、缺氧、缺乏营养和添加保护剂等。一：
12、长期保存 1ml 分枝杆菌菌液经离心沉淀后，去上清，将沉淀悬浮于1ml 7H-9OADC-0.5%TWEEN80-50%丙三醇中，-70oC保存。 OADC:0.5%BSA、0.2%葡萄糖、0.06%油酸、 140mmol/LNaCl和0.05%Tween802007-10-1125二：短期保存 1.1ml分枝杆菌菌液-70oC保存； 2.罗氏培养基上菌落加无菌液体石蜡后，4oC保存。结核分枝杆菌培养质量控制结核分枝杆菌培养质量控制 目前缺少标准的分离培养质量评价方目前缺少标准的分离培养质量评价方法！法！结核分枝杆菌培养的实验室系统结核分枝杆菌培养的实验室系统1. 1. 建立标准化的培养实验室
13、建立标准化的培养实验室2.2.快速快速/ / 安全的标本运输工作系统安全的标本运输工作系统3. 3. 便于患者标本集中培养便于患者标本集中培养4.4.安全可靠的实验室配套设备和材料安全可靠的实验室配套设备和材料5. 5. 工作人员培训工作人员培训分离培养实验室的基本要求分离培养实验室的基本要求房间及设施：一个独立房间、有上下水及电的供应、房间及设施：一个独立房间、有上下水及电的供应、通风和照明良好通风和照明良好仪器：培养箱、冰箱（仪器：培养箱、冰箱（44）、蒸汽凝固灭菌器（若）、蒸汽凝固灭菌器（若自制培养基）、涡旋振荡器、定时器、酒精灯自制培养基）、涡旋振荡器、定时器、酒精灯耗材：痰盒、培养管
14、及架移液、管废液（物）缸耗材：痰盒、培养管及架移液、管废液（物）缸试剂试剂: :氢氧化钠、蒸馏水、磷酸二氢钾、硫酸镁氢氧化钠、蒸馏水、磷酸二氢钾、硫酸镁7H2O7H2O、柠檬酸镁、谷氨酸钠、孔雀绿、鲜鸡蛋、柠檬酸镁、谷氨酸钠、孔雀绿、鲜鸡蛋（若自制培养基）（若自制培养基）生物安全：生物安全：型生物安全柜、高压灭菌锅、紫外灯、型生物安全柜、高压灭菌锅、紫外灯、消毒剂、工作服、口罩、帽、手套消毒剂、工作服、口罩、帽、手套按照高致病性病原微生物的要求进行检测按照高致病性病原微生物的要求进行检测；实验室应实验室应为为P2P2或或P2P2以上以上级级别的别的实验室，实验室，应有应有二级二级生物安全柜生物
15、安全柜；标准化的操作流程标准化的操作流程；良好的个人防护措施以及定期对操作人员进良好的个人防护措施以及定期对操作人员进行体检并进行生物安全培训行体检并进行生物安全培训；实验室应有完善的规章制度和应急预案等。实验室应有完善的规章制度和应急预案等。分离培养实验室生物安全基本要求分离培养实验室生物安全基本要求如何获得合格标本如何获得合格标本 标本采集：标本采集：痰液应来自患者肺部。痰标本应以脓痰、血痰液应来自患者肺部。痰标本应以脓痰、血痰、干酪痰或粘液痰为合格痰标本，唾液和痰、干酪痰或粘液痰为合格痰标本，唾液和口水为不合格标本。口水为不合格标本。按照标本采集时间分为即时痰、夜间痰、晨按照标本采集时间
16、分为即时痰、夜间痰、晨痰。痰。肺结核病人结核杆菌检出率与痰标本采集的肺结核病人结核杆菌检出率与痰标本采集的好坏有直接关系。医生或检验人员应告诉初好坏有直接关系。医生或检验人员应告诉初诊病人留取合格痰标本的方法。诊病人留取合格痰标本的方法。 如何获得合格标本如何获得合格标本标本保藏和运送：标本保藏和运送：在运送可感染人类的高致病性病原微生物菌在运送可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本时，须按照（毒）种或样本时，须按照可感染人类的可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定管理规定的要求进行审批、包装、运输、的要求进行审批、包装、运输、操作、保藏和管理。操作、保藏和管理。采集后立即送检，当天不能检查的痰标本置采集后立即送检，当天不能检查的痰标本置4 4C C冰箱保存。冰箱保存。 外送标本要认真核对痰盒和外送标本要认真核对痰盒和化验单上姓名、序号等项目，化验单上姓名、序号等项目，7 7天内必须进天内必须进行培养。行培养。结核菌培养及药敏标本采集送检须知培养一些指标培养一些指标污染率污染率: : 3-5% 3-5% ( (固体培养固
