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1、本文格式为Word版，下载可任意编辑人教版生物选修一53血红蛋白的提取和分离学案要点分析教 课题3 血红蛋白的提取和分开 1尝试对血液中血红蛋白的提取和分开。 2体验从繁杂体系中提取生物大分子的根本过程和方法。 3了解色谱法、电泳法等分开生物大分子的原理。 蛋白质的各种特性的差异如分子的_和_、所带_、溶解度、_和对其他分子的亲和力，等等，可以用来分开不同种类的蛋白质。 一、凝胶色谱法 1概念：凝胶色谱法也称做_，是根据_的大小分开蛋白质的有效方法。 2原理：大多数凝胶是由_化合物构成的小球体，内部有大量贯穿的通道，当不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量_的蛋白质轻易进入凝胶内部的通道，路程_
2、，移动速度_；而相对分子质量_的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在_移动，路程_，移动速度_。相对分子质量不同的蛋白质因此得以分开。 3凝胶材料：_性，_类化合物，如葡聚糖或_。 4概括过程： （1）_混合物上柱。（2）洗脱开头，_的蛋白质_进入凝胶颗粒内；相对分子质量_的蛋白质那么被排阻于凝胶颗粒之外。（3）_的蛋白质被滞留；_的蛋白质向下移动。（4）相对分子质量不同的分子完全分开。（5）_的蛋白质行程较短，已从_中洗脱出来，_的蛋白质还在行进中。 提示：洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速滚动。 二、缓冲溶液 1作用：在_内，能够抗拒外界的_对溶液_的影响，维持_根本不
3、变。 2配制：通常由_溶解于水中配制而成。调理缓冲剂的_就可以制得在不同_使用的缓冲液。 三、电泳 1概念：带电粒子在_的作用下发生_的过程。 2原理：大量重要的生物大分子，如_、_等都具有_的基团，在确定pH下，这些基团会带上_或_。在电场的作用下，这些带电分子会向着与所带电荷 _移动。电泳利用了分开样品中各种分子_以及分子本身的_、_不同，使带电分子产生不同的_，从而实现样品中各种分子的分开。 3分类：_凝胶电泳、_凝胶电泳。 在测定蛋白质相对分子质量时通常使用_凝胶电泳。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带_的多少以及_等因素。而在SDS聚丙烯酰胺凝胶电 泳中，SDS能使蛋白质发
4、生_，由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会_成单条肽链，因此测定的结果只是_的相对分子质量。同时SDS所带的大量负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷区别，使电泳迁移率完全取决于_。 四、蛋白质的提取和分开 蛋白质的提取和分开一般分为四步：_、粗分开、_和_。 1样品处理及粗分开 血液由_和_组成，其中红细胞最多。红细胞的组成中，除水分以外，约90%是_。血红蛋白由_条肽链组成，包括两条_和两条_。其中每条肽链环绕一个_基团，此基团可携带一分子氧或一分子_。血红蛋白因含有_而呈现_色。 （1）红细胞的洗涤 目的：去除_。 方法：采用_离心，如500 r
5、min1离心2 min，然后用胶头吸管吸出上层通明的黄色_，将下层_的红细胞液体倒入_，再参与五倍体积的_，缓慢搅拌 _，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有_，说明红细胞已洗涤明净。 （2）血红蛋白的释放 将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加_到_体积，再加40%体积的_，置于磁力搅拌器上充分搅拌10 min。在_和_的作用下，红细胞_，释放出血红蛋白。 （3）分开血红蛋白溶液：将搅拌好的混合液离心后可查看到试管中溶液分为4层（从上往下）： 第1层：_的甲苯层。 第2层：脂溶性物质的沉淀层_薄层固体。 第3层：_的水溶液红色通明液体。 第4层：其他杂质的_沉淀物。 将液体用_过滤，除
6、去_，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的_液体。 （4）透析：取1 mL的_溶液装入_中，将其放入盛有300 mL的物质的量浓度 为20 mmolL1的_中（pH为_），透析12 h。 透析袋一般是用硝酸纤维素（又称玻璃纸）制成的，能使_自由进出，而将_留存在袋内。透析可以去除样品中相对分子量较_的杂质，或用于更换样品的_。 2纯化凝胶色谱操作 处理后的样品还含有其他种类的蛋白质分子（如呼吸酶等），因此要将杂蛋白与血红蛋白举行分开。 第一步要制作_。其次步要_，由于_的凝胶和用_平衡好的凝胶的体积区别很大，所以装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。在装填凝胶柱时，不能有_存在。第三步
7、是样品的_和_。 3纯度鉴定SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 判断_的蛋白质是否达成要求，需要举行蛋白质纯度的鉴定。鉴定方法中使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。 五、留神事项 1红细胞的洗涤 洗涤次数、离心速度与离心时间特别重要。洗涤次数过少，无法除去_；离心速度过高和时间过长会使_等一同沉淀，达不到分开的效果，影响后续血红蛋白的提取纯度。 2色谱柱填料的处理 商品凝胶是枯燥的颗粒，使用前需直接放在_中膨胀。为了加速膨胀，可以将参与_的湿凝胶用_加热，逐步升温至接近沸腾。这种方法不仅时间_，还能除去凝胶中可能带有的_，摈弃胶粒内的_。 3凝胶色谱柱的装填 装填凝胶时要尽量_，从而降低颗粒之间的空隙
8、。不能有_存在，由于气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的_，降低分开效果。洗脱液不能_，露出凝胶颗粒，否那么需重新装填。 4蛋白质的分开 分开过程中，留心查看_在洗脱过程中的移动处境。假设色谱柱装填告成、分开操作正确，能领会地看到红色区带狭窄、平整、平匀一致地随着洗脱液缓慢移动；假设红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分开效果不好，与凝胶色谱柱的装填有关。 答案：外形 大小 电荷的性质和多少 吸附性质 一、1.调配色谱法 相对分子质量 2多糖类 较小 较长 较慢 较大 凝胶外部 较短 较快 3多孔 多糖 琼脂糖 4（1）蛋白质 （2）相对分子质量较小 分散 较大 （3）相对分子质量较小 相对分子质量较大 （5
9、）相对分子质量较大 层析柱 相对分子质量较小 二、1.确定范围 酸和碱 pH pH 212种缓冲剂 使用比例 pH范围内 三、1.电场 迁移 2多肽 核酸 可解离 正电 负电 相反的电极 带电性质不同 大小 外形 迁移速度 3琼脂糖 聚丙烯酰胺 SDS聚丙烯酰胺 净电荷 分子的大小 完全变性 解聚 单条肽链 分子的大小 四、样品处理 纯化 纯度鉴定 1血浆 血细胞 血红蛋白 四 肽链 肽链 亚铁血红素 二氧化碳 血红素 红 （1）杂蛋白 低速短时 血浆 暗红色 烧杯 生理盐水 10 min 黄色 （2）蒸馏水 原血液 甲苯 蒸馏水 甲苯 破碎 （3）无色通明 白色 血红蛋白 暗红色 滤纸 脂溶
10、性沉淀层 红色通明 （4）血红蛋白 透析袋 磷酸缓冲液 7.0 小分子 大分子 小 缓冲液 2凝胶色谱柱 装填凝胶色谱柱 干 缓冲液 气泡 参与 洗脱 3纯化 五、1.血浆蛋白 白细胞 2洗脱液 洗脱液 沸水浴 短 微生物 空气 3精细 气泡 洗脱次序 流干 4红色区带 1血红蛋白分开的完整过程 血红蛋白提取和分开的程序可分为四大步，分别是样品处理、粗分开、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除相对分子质量较小的杂质，即样品的粗分开；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化；结果经聚丙烯酰胺凝胶电泳举
11、行纯度鉴定。 不是全体种类的蛋白质的提取和分开都是这样的，蛋白质的来源和性质不同，分开方法区别很大。 提取血红蛋白的测验材料要选择哺乳动物血液，由于其红细胞中无细胞核，布局简朴，血红蛋白含量高。而提取DNA的测验材料要选择鸡的红细胞，由于其具有细胞核，含有DNA。 2缓冲溶液 在确定范围内，能对抗少量外来强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。缓冲溶液通常是由一种或两种化合物（缓冲剂）溶解于水中制得的，调理缓冲剂的配比就可制得不同pH范围的缓冲液。缓冲溶液的作用是维持回响体系的pH不变。在生物体内举行的各种生物化学过程都是在精确的pH下
12、举行的，受到氢离子浓度的严作风控。为了在测验室条件下切实地模拟生物体内的自然环境，就务必保持体外生物化学回响过程有与体内过程完全一致的pH。 测验中缓冲液用量要远多于血红蛋白溶液量，有利于杂质分子充分地向外分散。 3用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量 使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量时，可选用一组已知相对分子质量的标准蛋白同时举行电泳，根据已知相对分子质量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和相对分子质量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的相对分子质量。 概括步骤如下：（1）根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板；（2）SDS聚丙烯酰胺凝胶制备；（3）样品处理；（4）把凝胶固定于电泳装置上；（5）加样：按依次加样，加样量通常为1025 L，样品可以多加几个；（6）电泳；（7）剥胶；（8）染色；（9）脱色；（10）
