《基因操作原理》PPT课件

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1、基基 因因 操操 作作 原原 理理Principles of Gene Manipulation 绪论绪论一、什么是基因操作一、什么是基因操作将在细胞外产生的核酸分子将在细胞外产生的核酸分子插入病毒质粒或其它载体系统中插入病毒质粒或其它载体系统中再整合到那些本来不含该类物质的宿主中再整合到那些本来不含该类物质的宿主中从而形成一种新的可连续繁殖的有机体从而形成一种新的可连续繁殖的有机体目的目的要求掌握要求掌握基因操作中基本的普遍应用的原理基因操作中基本的普遍应用的原理并能自主设计通用操作方法和策略并能自主设计通用操作方法和策略要求的基础要求的基础生物学生物学生物化学生物化学分子生物学分子生物学参

2、考书籍参考书籍. Molecular Cloning V2.0, 1989 分子克隆实验指南分子克隆实验指南 2. 基因工程原理第二版（上册）基因工程原理第二版（上册）吴乃虎科学出版社吴乃虎科学出版社1998/2000 3. 分子生物学试剂产品目录分子生物学试剂产品目录如如 New England BioLabs 其它基因及其操作原理其它基因及其操作原理精编分子生物学实验指南精编分子生物学实验指南Internet 基因及其产物的共线性基因及其产物的共线性基因及其产物的基因及其产物的非非共线性共线性基因的重叠与可变性基因的重叠与可变性二、基因的基本概念二、基因的基本概念编码区编码区 ORF启动子

3、启动子 promoter RBS ribosomal binding site 终止区终止区 terminatorflanking sequence upstream / downstreamCap/tail 三、基因的基本结构组成三、基因的基本结构组成酶切酶切酶切酶切连接连接转化转化筛选筛选.GAATTC.CTTAAG.G.CTTAAAATTC.G.EcoRI三、基因克隆的通用策略三、基因克隆的通用策略Chromosome DNAvectorRecombinant plasmidsTarget gene第二章第二章 工具酶工具酶 切割位点可为获得DNA的物理图的特殊的标记利用限制性内切酶切割

4、产生特殊DNA片段的能力使得纯化那些DNA片段成为可能获得的限制性DNA片段可作为DNA操作中的基本介质第一节第一节 限制性内切酶限制性内切酶Restriction endonuclease任何物种都有排除异物保护自身的防御机制免疫系统细菌的限制与修饰系统限制性内切酶限制性内切酶 修饰酶修饰酶一、限制与修饰Restriction and modification 50年代初，发现 host controlled specificity噬菌体具有代表性和普遍性其在不同宿主中的转染频率，在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时受到限制的现象。E. coli KE. coli CEOP=1EOP=1EO

5、P=1EOP=10-41. 现象现象EOP Efficiency of platepfu plaque forming unit E.coli K E.coli B E.coli C KBC11110-410-410-410-411说明K和B菌株中存在一种限制系统可排除外来的DNA10-4的存活率是由宿主修饰系统作用的结果甲基化：A N6甲基-腺膘呤 C 5甲基胞嘧啶2. 限制酶的发现限制酶的发现60年代，限制内切酶和限制酶的概念1968年 首次从E.coli K中分离限制性内切酶需要ATP，S-腺苷甲硫氨酸（SAM）等有特定的识别位点但没有特定的切割位点切割位点达离识别位点1000bp以上1

6、970年 美国约翰霍布金斯大学 H.Smith 偶然发现流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）能迅速降解外源的噬菌体DNA无细胞提取液可降解E.coli DNA但不能降解自身DNA 即HindII酶5 .G T Py Pu A C. 33C A Pu Py T G. 5 G T C G A CG T T A A CG T C A A CG T T G A CY R5 .G A A T T C. 33C T T A A G. 5 EcoRI3. 限制酶的命名限制酶的命名宿主宿主 属名第一字母、种名头两个字母属名第一字母、种名头两个字母菌株或型号菌株或型号序号序号 罗马字罗马

7、字HindII EcoRI 早前加R, or M 菌株号和序号小写1986年下半年 发现 615R 98M1998年 10000细菌 古细菌 3000种酶 200多特异性3. 限制与修饰系统的种类限制与修饰系统的种类 亚单位组成, 识别序列的种类, 是否需要辅助因子分三类(I, II ,III)也有分四类，IIs类，即II 亚类(1) type II 93%识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割 3-OH,5-P，需需Mg2+，相应的修饰酶需，相应的修饰酶需only SAM 识别序列主要为识别序列主要为4-6bp， 或更长且呈二重对称的特殊序列或更

8、长且呈二重对称的特殊序列但有少数酶识别更长的序列或简并序列但有少数酶识别更长的序列或简并序列 切割位置因酶而异，有些是隔开的切割位置因酶而异，有些是隔开的R : 一般为同源二聚体一般为同源二聚体, 反向结合反向结合 作用在两条链作用在两条链M: 单体单体 DNA同时切割同时切割, M只作用新链只作用新链type IIs 占占5% 识别位点非对称识别位点非对称, 非间断非间断 4-7bp切割位点可能在切割位点可能在20bp范围内。范围内。R: 与与 type II 具有相同的辅助因子要求具有相同的辅助因子要求M: 通常由两个通常由两个M来完成来完成,各作用一条链各作用一条链(2) type I

9、和和 typeIIItype I (1%) 种类少 如 EcoR EcoBR酶和M酶 各作为一个亚基存在于酶分子中 即R基和M亚基，还有负责识别DNA序列的S亚基 分别由hsdR，hsd M，hsdS基因编码 属于同一操纵子（转录单位）EcoK R2M2S EcoB R2M4S2P1hsdRP2hsdMhsdS 识别位点识别位点EcoB TGA*(N)8TGCT A*EcoK AAC (N6)GTGC A* 甲基化位点 可能的甲基化位点切割位点1000bp以外, 无特异性R-M+突变突变 M+S- R- M-Gene type phenotype M- R- M- 保全机制保全机制typeII

10、I (64Nt=44=2566Nt=46=4096 回文对称 4 6 8 5 7EcoRI GAATTC CTTAAGHindIII AAGCTT TTCGAA 非对称AccBSI CCGCTC (-3/-3)BssSI CTCGTGNumbers in parentheses indicate point of cleavage for non-palindromic enzymes 多识别序列 (简并序列)AccI GTMKACHindII GTYRAC 间断对称AlwNI CAGNNNCTGDdeI CTNAG3切割位置 内部 大多数AccBSI CCGCTC (-3/-3) GGCGA

11、GAaaaI NNNNNN (-2/-4) NNNNNN例 两端 EcoRII CCWGG Sau3AI GATCNlaIII CATG 两侧 BcgI (10/12)CGA(N)6TGC(12/10) 10(N)CGA(N)6TGC(N)1212(N)GCT(N)6 ACG(N)10TspRI CASTGNN/NNCAC(G)TGNNNNGTG(C)ACNN 单侧 BbvI GCAGC N(8/12)BspMI ACCTGC (N4) TGGACG(N8) I-prefix & pI-prefix三、限制性内切酶产生的末端Cohesive terminus (end)1. 匹配粘端(粘性末端

12、）末端相同 在对称轴5侧切割底物DNA双链交错断开5protrudingEcoRI NNGAATTCNN NNCTTAAGNN NNG AATTCNNNNCTTAA GNN 3-侧3突出末端 5 recessedKpnI GGTACC CCATGG2.平端 Blunt end在对称轴上同时切割DNA的两条链HaeIII GGCC EcoRV GATATCXmnI GAANNNNTTC3.非对称突出端非对称突出端(相同相同) 来自非对称识别序列来自非对称识别序列 CCTCAGC BbvCI GGAGTCG 简并序列AccIGT/MKACGTATACGTAGACGTCTACGTCGAC 间隔序列

13、DraIII CACNNNGTG EarI CTC T TC (1/4) GAGAAG4.同裂酶(isoschizomer)识别相同序列的限制酶称同裂酶 同序同切 HindII HincII GTY/RAC HpaII HpaII C/CGG MobI Sau3AI /GATC同功酶？ 同序异切KpnI GGTAC/C Acc65I G/GTACC Asp718I G/GTACCAatII GACGT/C BsaHI GR/CGYC “同功多位”EcoRI G/AATTC ApoI R/AATTYHpaI GTT/AAC HincII GTY/RAC 其它 SalI G/TCGAC AccI

14、GT/MKAC HincII GTY/RAC平端同裂酶EcoRI GAATTC MfeI CAATTG ApoI RAATTYSpeINheIXbaIStyIA C T A G T G C T A G C T C T A G AC C W W G GBamHI GGATCC Sau3AI GATC ClaI ATCGAT AccI GTMKAC pUC19 BstBI TTCGAATaqI TCGA四、末端长度对切割的影响指导双酶切以及酶切 PCR产物 2hr 20hrAccI CCGGTCGACCGG 0 0HindIII CAAGCTTG 0 0 CCAAGCTTGG 0 0 CCCAAG

15、CTTGGG 10% 75%EcoRI GGAATTCC 90 90利用Labeled 寡核苷酸 在20 Units RE 时 酶切 1 ug oligo1. Labeled 寡核苷酸 PstI GCTGCAGC 0 0 TGCACTGCAGTGCA 10 10 AACTGCAG(N) 14 90 90 CTGCAG(N) 20 0 02. DNA片段（线性载体） 10/ug DNA 60minCGTACG CTCGAG GAATTC CTGCAG GATATCEcoRI L1TMUS29XhoI 100% (1) PstI 88(1) CTCGAG GAATTC CTGCAG XhoI Ec

16、oRI PstI .CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC. XhoI EcoRI PstI EcoRI initial cut L1TMUS29cleavage efficiency XhoI 97% 1 base PstI 37% 1 baseXhoI : 1 EcoRI 100% PstI : 1 EcoRI 88%L1TMU39NheI 100(1) GGATCC GAATTC GCTAGC BamHI EcoRI NheI由于不计算单链部分的4个碱基，因此设计引物时应加4个。在双酶切多克隆位点时，选酶切秩序五、位点偏爱 (site preferences)单位酶、在建议使用的缓冲液及温度下，在20l反应液中反应1小时，使1g DNA完全消化所需的酶量(多数情况用 DNA来测试)NEB in 50l 体系/Pharmacia 50l某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割1975 EcoRI切割 phage中的5个位点，并不是随机的，靠近右端的位点，比分子中间的位点切割快10倍。1976 EcoRI在腺病毒2 DNA中的切割速率不同。