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1、基因工程制药简介张义浜2017-05-20 早期部分基因工程产品的研制、开发、上市时间早期部分基因工程产品的研制、开发、上市时间产品产品研制研制国家国家用途用途上市上市国家国家人生长激素释放抑制素人生长激素释放抑制素(SRM)1977日本日本巨人症巨人症人胰岛素人胰岛素1978美国美国糖尿病糖尿病1982欧洲欧洲人生长激素（人生长激素（HGH）1979美国美国侏儒症侏儒症1985美国美国人人-干扰素（干扰素（IFN）1980美国美国病毒病毒1985欧洲欧洲乙肝疫苗乙肝疫苗1983美国美国乙肝乙肝1986欧洲欧洲人白细胞介素（人白细胞介素（IL）1984美国美国肿瘤肿瘤1989欧洲欧洲人促红细胞
2、生成素（人促红细胞生成素（EPO）日本日本贫血贫血1988欧洲欧洲人粒细胞集落刺激因子人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)白血病白血病1991美国美国人组织纤溶酶原激活剂（人组织纤溶酶原激活剂（t-PA）血栓症血栓症1987 美国美国批准年份药品批准年份药品1989IFN-1b1999125Ala IL-2、人胰岛素、Anti-CD3鼠源单抗1992IFN-2a2000人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）表皮生长因子（EGF）、EGF衍生物霍乱疫苗（rBS-WC）1994白介素2（IL-2）2001抗IL-8鼠源单抗凝乳剂1995乙肝疫苗（酵母）2003IL-11、肿瘤细胞细胞核嵌合抗体注射液重
3、组葡激酶（r-SAK）1996IFN- 2b，乙肝疫苗（CHO）粒细胞集落刺激因子（G-CSF）2004重组人p53腺病毒注射液抗EGFR人源单抗1997粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）重组链激酶（-SK）、EPO2005重组人脑利钠肽、重组人血管内皮抑素重组人5型腺病毒注射液（H101）、rhTNF-、rhTPO1998IFN-、125Ser IL-2、生长激素（GH）痢疾疫苗、牛碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）2006重组TNFR-Fc融合蛋白上游阶段选择表达系统主要考虑：p必须保证所表达的蛋白质具有生物活性p考虑基因工程蛋白质表达量的多少p蛋白质分离纯化的难易程度下游阶段基因
4、的克隆工 具 酶功 能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标记等反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除
5、末端磷酸基常用的方法常用的方法:cDNA克隆示意图DNA聚合酶聚合酶ImRNA 反转录酶反转录酶ss-DNAds-cDNAds-cDNA核酸酶核酸酶S1序列已知；序列已知；直接直接成本成本DNA合成仪p基因基因的克隆与表达的克隆与表达一、宿主菌的选择一、宿主菌的选择宿主菌应满足以下要求：宿主菌应满足以下要求：具有高浓度、高产量、高产率；具有高浓度、高产量、高产率；能利用易得廉价原料；能利用易得廉价原料；不致病、不产生内毒素；不致病、不产生内毒素；发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态；发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态；容易进行代谢调控；容易进行代谢调控；方便重组方便重组DNA操作
6、操作；产物容易提取纯化。产物容易提取纯化。包涵体包涵体包涵包涵体体（3）链霉菌 重要的工业微生物。不致病、使用安全，分泌能力强，可将表达产物直接分泌到培养液中，具有一定的糖基化能力2 2、真核细胞、真核细胞（1 1）酵母）酵母 特点：特点：真核生物细胞，表达产物能糖基化；真核生物细胞，表达产物能糖基化；基因组小，仅为大肠杆菌的基因组小，仅为大肠杆菌的4 4倍；倍；世代时间短，繁殖迅速；世代时间短，繁殖迅速；基因操作与原核生物相似；基因操作与原核生物相似；建立了有分泌功能的表达系统，将产物分泌出胞外，分建立了有分泌功能的表达系统，将产物分泌出胞外，分离纯化工艺相对简单。离纯化工艺相对简单。（2
7、2）丝状真菌）丝状真菌 特点：特点：真核生物和原核生物基因表达基因表达过程示意图克隆克隆载体载体: 克隆克隆了外源了外源DNA后，转入宿主细胞中进行繁殖，后，转入宿主细胞中进行繁殖，使克隆使克隆的的DNA片段数量大大增加片段数量大大增加表达表达载体载体: 将将外源基因或外源基因或DNA片段在宿主细胞中表达片段在宿主细胞中表达蛋白质蛋白质插入型载体插入型载体: 将外源基因或将外源基因或DNA插入其中插入其中置换型载体置换型载体: 切除切除载体部分载体部分DNA，代之以外源基因或，代之以外源基因或DNA。载体（载体（vector）质粒质粒（plasmid）质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主细胞染
8、色体外质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主细胞染色体外而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。绝大多数。绝大多数质粒是质粒是DNA型的，天然型的，天然DNA质粒具有共价、封闭、环状质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即的分子结构，即cccDNA。基因克隆的载体质粒基因克隆的载体质粒DNA分子分子都具有复制子、选择性标记、克隆位点都具有复制子、选择性标记、克隆位点。原核细胞原核细胞表达载体表达载体非融合型pKK223-3 分泌型PIN-ompA1 融合蛋白表达载体pGEX结构 包涵体型pBV220结构 融合蛋白表达载体 非融合型表达载体 分泌型表达载体 包涵
9、体型表达载体p基因工程菌的培养基因工程菌的培养基因工程菌发酵的基本操作方式有： 分批培养 分批培养操作简单，但因不能控制生长，获得的菌体密度也有限 半连续培养（补料分批） 在一次投料发酵的基础上，流加一定量的营养，使细胞进一步的生长，或得到更多的代谢产物 连续培养 不断地流加营养，并不断地取出发酵液。连续培养则多用于动力学特性和稳定性等研究。 透析培养 固定化培养基因工程菌培养方式基因工程菌培养方式补料分批培养 补料分批培养是将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法。 在分批培养中，为保持基因工程菌生长所需的良好微环境，延长其生长对数
10、期，获得高密度菌体，通常把溶氧控制和流加补料措施结合起来，根据基因工程菌的生长规律来调节补料的流加速率。连续培养 连续培养是将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至菌体浓度达到一定程度后，开动进料和出料蠕动泵，以一定稀释率进行不间断培养。 连续培养可以为微生物提供恒定的生活环境，控制其比生长速率，为研究基因工程菌的发酵动力学、生理生化特性、环境因素对基因表达的影响等创造了良好的条件。 但由于基因工程菌的不稳定性，连续培养比较困难。为了解决这一问题，人们将工程菌的生长阶段和基因表达阶段分开，进行两阶段连续培养。在这样的系统中关键的控制参数是诱导水平、稀释率和细胞比生长速率。优化这三个参数以保证在第一阶
11、段培养时质粒稳定，菌体进入第二阶段后可获得最高表达水平或最大产率。透析培养 透析培养技术是利用膜的半透性原理使培养物和培养基分离，其主要目的是通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。 采用膜透析装置是在发酵过程中用蠕动泵将发酵液抽出打入罐外的膜透析器的一侧循环，其另一侧通入透析液循环，在补料分批培养中，大量乙酸在透析器中透过半透膜，降低培养基中的乙酸浓度，并可通过在透析液中补充养分而维持较合适的基质浓度，从而获得高密度菌体。 膜的种类、孔径、面积，发酵液和透析液的比例，透析液的组成，循环流速，开始透析的时间和透析培养的持续时间段都对产物的产率有影响固定化培养 基因工程菌培养的一大
12、难题是如何维持质粒的稳定性。有人将固定化技术应用到这一领域，发现基因工程菌经固定化后，质粒的稳定性大大提高，便于进行连续培养，特别是对分泌型菌更为有利。由于这一优点，基因工程菌固定化培养研究已得到迅速开展。主要表现在重组质粒的不稳定性， 两种表现形式： 1）结构不稳定性 重组 DNA 分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表观生物学功能的丧失 2）分配不稳定性 整个重组 DNA 分子从受体细胞中逃逸基因工程菌不稳定性的可能产生机制：受体细胞中限制修饰系统对外源重组 DNA 分子的降解外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常生长代谢 能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生应激
13、反应：关闭合成途径，启动降解程序重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配 重组质粒逃逸的基本原因受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排培养基比生长速率限制性基质温度pH 和溶氧外源基因表达遗传特性 影响基因工程菌稳定性的因素载体的选择宿主的选择外源基因整合到宿主染色体上发酵工艺 1.培养基 一些基因重组菌在复合培养基中显示较高的质粒稳定性 微生物在含有有机氮源如酵母抽提物、蛋白胨等营养丰富的复合培养基中培养时，由于培养基提供了生长必须的氨基酸和其他物质，微生物的生长较基本培养基快。 培养条件对培养条件对基因工程菌基因工程菌稳定性的影响稳定性的影响2.比生长速率 基因重组菌的比生长速率对质
14、粒稳定性有很大影响。提高比生长速率有助于提高质粒稳定性。 基因重组菌的比生长速率与培养环境有关，如温度，pH，溶氧，限制性营养物质浓度，有害代谢产物浓度等。在一定的温度和 pH 下，限制性基质浓度往往是决定比生长速率的主要因素。3.限制性基质 一般培养基中各成分并不是完全平衡的，经过一段时间的培养，微生物的生长通常会受到一种或几种物质的限制。限制性基质的种类对重组菌有不同的影响4. pH 和溶解氧 pH和溶氧是影响微生物生长的重要参数，在发酵罐培养基因重组菌时，通常都需要维持一定的 pH 和溶氧水平。在基因重组菌的高密度培养时，为了维持所需的溶氧水平，除了提高搅拌转速和通气量，往往还要在通入的
15、空气中补充氧气，以提高发酵罐的供氧能力。5.外源基因的表达 外源基因的表达会引起重组质粒的不稳定；尤其当外源基因高效表达时，有可能因竞争利用物质、能量、核糖体等干扰宿主细胞的正常代谢活动，并造成质粒不稳定。 例如，吲哚丙烯酸（IAA ）是 trp 操纵子阻遏物的部分去阻遏剂，在培养大肠杆菌 MV12（pVH5）时，在培养基中加入不同量的 IAA，发现随 IAA 量的增加，pVH5 带有的分支酸合成酶和色氨酸合成酶基因的表达水平有很大提高，同时比生长速率下降，培养液中 Trp 的比例上升。电泳分析表明 60%70% 色氨酸合成能力丧失是由于质粒结构的变化，其余是由于质粒丢失造成。1、改进载体受体
16、系统 以增加质粒稳定性为目的的构建方法包括： 1）将 R1 质粒上的 parB 基因引入表达型载体中，其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞 2）正确设置载体上的多克隆位点，禁止 DNA 片段插在稳定区内 3）将受体细胞的致死性基因安装在载体上，同时构建条件致死性的相应受体系统，如大肠杆菌的 ssb 基因（ DNA 单链结合蛋白编码基因） 提高基因工程菌稳定性的策略提高基因工程菌稳定性的策略2、施加选择压力 根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素 药物和食品生产时禁止使用抗生素；加入大量的抗生素会使生产成本增加；添加一些容易被水解失活的抗生素，只能维持一定时间；添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力 载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营养组份 培养基复杂，成本较高 提高基因工程菌稳定性的策略提高基因工程菌稳定性的策略3、分阶段控制培养 因外源基因表达造成质粒不稳定时，可以考虑将发酵过程分阶段控制 在生长阶段使外源基因处于阻遏状态，避免因表达造成不稳定性问题的发生；在获得需要的菌体密度后，再去阻遏或诱导外源基因表达。 连续培养时可以考虑采
