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1、细胞培养的基本条件演示文稿当前1页，共65页，星期日。（优选）细胞培养的基本条件当前2页，共65页，星期日。一、实验室设计及设备器材一、实验室设计及设备器材1. 细胞培养室设计原则及要求细胞培养室设计原则及要求保证无微生物污染和不受其他有毒、有害因素的影响具体工作具体工作：器皿洗刷试剂和培养液的配制制备细胞孵育细胞传代细胞的冻存、复苏和运输当前3页，共65页，星期日。必须树立无菌观念，坚持一贯的无菌操作，进行无菌处理。实验室应分为无菌室、准备室和洗刷消毒室，除洗刷消毒室须分隔开外，无菌室和准备室可在同一房间内，但需划分出不同功能区，即无菌操作区和培养、观察区。无菌观念无菌观念当前4页，共65页
2、，星期日。1）无菌室）无菌室为无菌操作而设计的空间，包括操作间和缓冲间。操作间又可分为细胞室和感染室缓冲间能保护无菌间的无菌环境，可兼有更换无菌衣帽和进行一些简单操作（如放孵育箱、离心等）的功能。整个面积约10m2，通入经滤过的无菌空气，与周围实验室比较应保持正压，常备紫外灯，室内其他陈设尽量减少。当前5页，共65页，星期日。 无菌室结构模式图无菌室结构模式图 back 当前6页，共65页，星期日。使用无菌室时应按以下顺序：使用无菌室时应按以下顺序：熟悉实验计划，背鳍必要的材料和器具，杜绝试验过程中反复出入无菌室。传戴无菌衣帽和口罩。关闭杀菌灯，通过一定路线拿如必要物品（应尽量减少出入的次数）
3、。手部消毒后再进行操作。完成实验后将用完的物品移出室外 。擦净实验台，退出后打开灭菌灯。当前7页，共65页，星期日。每日（使用前）紫外照射（12小时），每周甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）每月新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。实际工作中，要根据无菌室建筑材料的差异来选择合适的消毒方法。无菌室的维护无菌室的维护当前8页，共65页，星期日。注意防止无菌室的污染。造成无菌室污染的可能包括：送入无菌室的风没有被过滤除菌；进出无菌室时，能使外界空气直接对流进无菌室的操作间；等。 当前9页，共65页，星期日。2）超净工作台超净工作台（净化工作台）（净化工作台）比较密闭，分垂直流和侧流式，外界空气
4、通过滤器从上面、侧面或正面流入操作箱内，并能形成气流屏障，以保持台面无菌。n超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。 当前10页，共65页，星期日。超净台的使用与保养：超净台的使用与保养： 平均风速保持在平均风速保持在0.32-0.48米米/秒为宜秒为宜使用前最好开启超净台内紫外灯照射使用前最好开启超净台内紫外灯照射1030分钟，分钟，然后让超净台预工作然后让超净台预工作1015分钟，以除去臭氧和分钟，以除去臭氧和使用工作台面空间呈净化状态；使用工作台面空间呈净化状态；使用完毕后，要用使用完毕后
5、，要用70%酒精将台面和台内四周擦拭干酒精将台面和台内四周擦拭干净，以保证超净台无菌。还要定期用福尔马林熏蒸超净，以保证超净台无菌。还要定期用福尔马林熏蒸超净台净台 当前11页，共65页，星期日。无菌工作台操作布局示意图无菌工作台操作布局示意图当前12页，共65页，星期日。3）无菌箱）无菌箱当前13页，共65页，星期日。（1）大型设备工具类 无菌室、实验室、超净工作台、无菌操作箱等二氧化碳（CO2）孵箱、恒温孵箱、试管架 2. 设备器材设备器材当前14页，共65页，星期日。nCO2培养箱设定的条件为37 ，5CO2 。n使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松
6、，以保证通气。保持培养箱内空气干净。定期消毒（90 ，14 h)。箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。当前15页，共65页，星期日。倒倒置置显显微微镜镜倒置显微镜、普通显微镜、实体解剖显微镜及照相系统当前16页，共65页，星期日。高速离心机（水平式5004000r/min）普通、低温冰箱及液氮装置药品柜、器械柜、实验台等当前17页，共65页，星期日。（2）消毒灭菌设备）消毒灭菌设备高压蒸汽灭菌器干热灭菌器滤过器（蔡氏滤器、微量超滤膜滤器等）紫外灯、离子发生器耐酸耐高温容器、吸管自动冲洗器、玻璃器皿清洗箱当前18页，共65页，星期日。（3）配液用具蒸馏水制作系统、
7、阴离子交换树脂装置。天平称量系统。pH仪或试纸（精密）量筒、漏斗、溶量瓶、磁力搅拌器等当前19页，共65页，星期日。（4）制备、培养、保存细胞用品刀、剪、镊等解剖用具，80200目尼隆网或不锈钢网，血细胞计数板培养皿、培养瓶、培养管、培养板（4、6、12、24、48、96孔）、离心管吸管、滴管、吹打管、试管500ml、250ml、100ml、50ml等溶液瓶涡流混匀器、恒温磁力搅拌器、恒温水浴锅等细胞冻存管等当前20页，共65页，星期日。当前21页，共65页，星期日。培 养 板当前22页，共65页，星期日。 培养瓶当前23页，共65页，星期日。酶标仪 微孔板震荡器当前24页，共65页，星期日。
8、二、实验器材的处理二、实验器材的处理防止微生物污染和细胞污染1. 清洗清洗1）玻璃器皿的清洗）玻璃器皿的清洗（1）浸泡）浸泡 新玻璃器皿使用前得先用自来水简单刷洗，然后用5盐酸浸泡过夜；用过的玻璃器皿往往附有大量蛋白质和油脂， 干涸后不易刷洗掉，故用后应立即浸入清水中备刷洗。当前25页，共65页，星期日。注意让水灌满瓶皿，以利充分浸泡、冲洗。有污染的器皿必须先消毒灭菌后再浸泡、冲洗。（2）刷洗）刷洗软毛刷优质洗涤剂或专用洗涤剂轻刷，不宜刷洗次数太多当前26页，共65页，星期日。（3）浸酸）浸酸器皿干燥后浸酸器皿内要充满清洁液，勿留气泡注意安全浸清洁液处理后的器皿必须彻底冲洗（4）冲洗）冲洗自来
9、水流水冲洗蒸馏水冲洗3遍当前27页，共65页，星期日。清洁液配制注意事项清洁液配制注意事项选用耐酸塑料桶或不锈钢桶配置为宜清洁液腐蚀性极强，配置与应用时必须小心，做好防护清洁液配好后呈棕红色，带边绿色是标明失效缓缓加入浓硫酸，切忌过急，否则将大量产热而发生危险（决不可将重铬酸钾液倒入浓硫酸中）先将重铬酸钾溶于水中（用玻璃棒搅拌助溶，有时不能完全溶解）当前28页，共65页，星期日。清洗示意图清洗示意图白箭头：玻璃制品 黑箭头：橡胶制品 back当前29页，共65页，星期日。2）塑料器皿冲洗）塑料器皿冲洗流水冲洗晾干后包装，以备灭菌蒸馏水漂洗3次25盐酸浸泡30min自来水冲洗2氢氧化钠（NaOH
10、）浸泡过夜晾干自来水冲洗当前30页，共65页，星期日。3）胶塞等橡胶类用品的处理）胶塞等橡胶类用品的处理自来水冲洗2氢氧化钠（NaOH）煮沸15 min25盐酸煮沸15min蒸馏水漂洗5次以上晾干后包装自来水冲洗自来水冲洗5次以上蒸馏水煮沸10min烘干备用高压灭菌当前31页，共65页，星期日。4）金属器械的清洗）金属器械的清洗新的先用沾有汽油的纱布擦去油脂再用水洗净最后用乙醇棉球擦拭，晾干用过的先以清水煮沸消毒，再擦拭干净使用前以蒸馏水煮沸10分钟，或包装好后101.3 kPa高压灭菌15分钟当前32页，共65页，星期日。5）除菌滤器的处理）除菌滤器的处理2、包装、包装目的：目的：防止消毒灭
11、菌后再次遭受污染包装材料：包装材料：包装类型：包装类型：常用的包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、纸或棉线绳局部包装全包装当前33页，共65页，星期日。3、消毒灭菌、消毒灭菌1.干烤干烤7.抗生素消毒灭菌抗生素消毒灭菌6.熏蒸消毒熏蒸消毒5.射线射线4.紫外线紫外线2.高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌3.滤过灭菌滤过灭菌当前34页，共65页，星期日。当前35页，共65页，星期日。消毒剂类消毒剂类别别名称名称浓度浓度(%)用途用途重金属盐重金属盐红汞红汞2皮肤、粘膜、小创面消毒皮肤、粘膜、小创面消毒硫柳汞硫柳汞0.01生物制品防腐生物制品防腐氧化剂氧化剂高锰酸钾高锰酸钾0.1皮肤、
12、尿道、水果、蔬菜消毒皮肤、尿道、水果、蔬菜消毒过氧化氢过氧化氢3皮肤、粘膜、创伤消毒皮肤、粘膜、创伤消毒过氧乙酸过氧乙酸0.20.5塑料、玻璃、人造纤维消毒塑料、玻璃、人造纤维消毒卤素类卤素类碘液碘液2.5皮肤消毒皮肤消毒醇类醇类乙醇乙醇7075皮肤、体温计消毒皮肤、体温计消毒酚类酚类石炭酸石炭酸35地面、器皿表面和排泄物消毒地面、器皿表面和排泄物消毒来苏来苏35同上、也常用于手及皮肤消毒同上、也常用于手及皮肤消毒表面活性表面活性剂剂新洁尔灭新洁尔灭0.1手术器械消毒手术器械消毒酸碱类酸碱类生石灰生石灰1:41:8排泄物、地面消毒排泄物、地面消毒染料染料龙胆紫龙胆紫24表浅创伤消毒表浅创伤消毒
13、8.化学消毒剂化学消毒剂当前36页，共65页，星期日。三、培养用液三、培养用液是维护组织细胞生存、生长及进行细胞培养各项操作过程中所需的基本溶液平衡盐溶液（balanced salt solution, BSS）天然培养液合成培养液当前37页，共65页，星期日。1. 细胞培养对水的要求细胞培养对水的要求纯化水蒸馏水（三蒸水）存放时间最好不要超过2周（一）离子交换装置（一）离子交换装置（二）蒸馏水装置（二）蒸馏水装置当前38页，共65页，星期日。2. 平衡盐溶液平衡盐溶液主要成分：主要成分：无机盐葡萄糖酚红：指示剂常用的常用的BSS种类：种类：（一）（一）Hanks液液（三）（三）PBS液液（二
14、）（二）Earle液液当前39页，共65页，星期日。BSS的配制要求：的配制要求：要防止钙的沉淀要有良好的缓冲作用主要用途：主要用途：作为配制培养液的基础溶液配制各种试剂用于洗涤组织和细胞当前40页，共65页，星期日。水：新鲜配置的三蒸水或去离子水1. pH7.2 PBS贮备液（10）配法 NaCl 8.5 g KCl 0.2 g Na2HPO412H2O 2 .85 g KH2PO4 0.27g 溶于100 ml双蒸水中2. PBS使用液配法 贮备液 50ml 双蒸水 450ml 细胞培养用液的配制细胞培养用液的配制当前41页，共65页，星期日。成分成分RingerRingerPBSPBSE
15、arleEarleHanksHanksDulbeccoDulbeccoD-HanksD-HanksNaCl(g)8.00 8.00 6.80 8.00 8.00 8.00 KCl(g)0.42 0.20 0.40 0.40 0.20 0.40 CaCl(g)0.25 0.20 0.14 0.10 MgCL6H2O(g)0.10 MgSO47H2O(g)0.20 0.20 Na2HPO4H2O(g)1.56 0.06 0.06 NaH2PO42H2O(g)0.14 1.42 KH2PO4(g)0.20 0.06 0.20 0.06 NaHPO4(g)2.20 0.35 0.35 葡萄糖(g)1.
16、00 1.00 酚红(g)0.02 0.02 0.02 0.02 几种常用的几种常用的BSS配方（配方（g/L）当前42页，共65页，星期日。3. 细胞培养常用试剂细胞培养常用试剂1）细胞分离液（消化液）：）细胞分离液（消化液）：胰蛋白酶依地酸二钠（disodium edetate,EDTA-2Na）胶原酶常用的消化液：常用的消化液：当前43页，共65页，星期日。 胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25 。用滤器过滤除菌。（1）胰蛋白酶）胰蛋白酶当前44页，共65页，星期日。蛋白酶液消化时间：2-10分钟。最适作用条件为pH8.0、37用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 当前45页，共65页，星期日。（2）EDTA(0.01 -0.02%)一种化学螯合剂，其溶液又称Versene液对细胞有一定的解离作用毒性小，价格低廉，使用方便当前46页，共65页，星期日。（3）胰酶）胰酶
