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1、（优选）pp基因工程的基本操作程序1页，共34页，星期二。阅读阅读P72P72并思考并思考1 1、什么是目的基因？、什么是目的基因？2 2、获取目的基因的方法有哪些？、获取目的基因的方法有哪些？2页，共34页，星期二。从从基因文库基因文库中获取目的基因中获取目的基因基因文库基因文库 基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库（如（如cDNAcDNA文库）文库）3页，共34页，星期二。基因文库的构建过程基因文库的构建过程基基因因组组文文库库限制酶限制酶供体细胞的供体细胞的全部全部DNA大量大量DNA片段片段拼接到载体上拼接到载体上导入受体细胞扩增导入受体细胞扩增4页，共34页，星期二。利用利用
2、PCRPCR技术技术扩增目的基因扩增目的基因PCRPCR的全称：的全称： 聚合酶链式反应聚合酶链式反应PCRPCR的原理：的原理： 体外的体外的DNADNA复制复制 5页，共34页，星期二。模板模板原料原料引物引物酶酶控制温度控制温度利用利用PCRPCR技术技术扩增目的基因扩增目的基因目的基因目的基因DNADNA四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸某单链某单链DNADNA分子片段分子片段耐热的耐热的DNADNA聚合酶聚合酶PCRPCR仪自动调控仪自动调控PCRPCR的条件：的条件：6页，共34页，星期二。PCRPCR的过程：的过程：利用利用PCRPCR技术技术扩增目的基因扩增目的基因变性变性(90-9
3、5)(90-95)复性复性(55-60)(55-60)延伸延伸(70-75)(70-75)7页，共34页，星期二。cDNA基因文库的构建过程基因文库的构建过程mRNAmRNA单链单链DNADNA 双链双链DNADNA逆转录逆转录cDNA文库（部分基因组文库）文库（部分基因组文库）8页，共34页，星期二。依据目的基因的有关信息。依据目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列如：根据基因的核苷酸序列 基因在染色体上的位置基因在染色体上的位置 基因的转录产物基因的转录产物mRNAmRNA 基因翻译产物蛋白质等特性。基因翻译产物蛋白质等特性。从从基因文库基因文库中分离获取目的基因中分离获取目的基因9
4、页，共34页，星期二。用化学方法直接用化学方法直接人工合成人工合成条件：条件：基因较小，核苷酸序列已知。基因较小，核苷酸序列已知。10页，共34页，星期二。二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建核心核心用切目的基因相用切目的基因相同的限制性内切同的限制性内切酶切割质粒酶切割质粒11页，共34页，星期二。二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建核心核心12页，共34页，星期二。二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建核心核心目的基因目的基因13页，共34页，星期二。外显子内含子与RNA聚合酶结合位点编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点编码区原核生物基因原核生
5、物基因真核生物基因真核生物基因14页，共34页，星期二。二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建核心核心1 1、基因表达载体的组成、基因表达载体的组成目的基因目的基因启动子启动子终止子终止子标记基因等标记基因等15页，共34页，星期二。二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建核心核心2 2、基因表达载体的构建目的：、基因表达载体的构建目的：a.a.使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。可以遗传给下一代。b.b.使目的基因能够表达和发挥作用。使目的基因能够表达和发挥作用。16页，共34页，星期二。三、目的基因导入受体细胞三、目的基因导入
6、受体细胞 1 1、目的基因导入植物细胞常用的方法是、目的基因导入植物细胞常用的方法是什么？具体过程是怎样的？什么？具体过程是怎样的？ 2 2、目的基因导入动物细胞常用的方法是、目的基因导入动物细胞常用的方法是什么？基本操作程序是怎样的？什么？基本操作程序是怎样的？ 3 3、目的基因导入大肠杆菌的方法是怎样的、目的基因导入大肠杆菌的方法是怎样的？钙离子有什么作用？钙离子有什么作用？17页，共34页，星期二。1.1.目的基因导入植物细胞目的基因导入植物细胞常用的方法常用的方法: : 农杆菌转化法、农杆菌转化法、基因枪法、基因枪法、 花粉管通道法花粉管通道法农杆菌的特点农杆菌的特点: :a.a.易感
7、染双子叶植物和祼子植物。易感染双子叶植物和祼子植物。b.Tib.Ti质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA可转移到受体细胞，并可转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的整合到受体细胞染色体的DNADNA上上三、目的基因导入受体细胞三、目的基因导入受体细胞18页，共34页，星期二。三、目的基因导入受体细胞三、目的基因导入受体细胞1.1.目的基因导入植物细胞目的基因导入植物细胞农杆菌转化法的导入过程农杆菌转化法的导入过程: :构建基因表达载体构建基因表达载体转入转入农杆菌农杆菌植物细胞植物细胞导入导入稳定维持和表达稳定维持和表达19页，共34页，星期二。. .目的基因导入动物细胞目的基因导入动物细胞
8、常用的方法常用的方法: : 显微注射技术显微注射技术操作程序：操作程序：三、目的基因导入受体细胞三、目的基因导入受体细胞a.a.先提纯含目的基因的表达载体先提纯含目的基因的表达载体 b.b.从动物体内取出卵从动物体内取出卵( (受精卵）受精卵）c.c.显微注射仪进行显微注射显微注射仪进行显微注射 d.d.将含目的基因的受精卵移植到输卵管或将含目的基因的受精卵移植到输卵管或子宫中发育成新个体子宫中发育成新个体20页，共34页，星期二。21页，共34页，星期二。3.3.目的基因导入微生物细胞目的基因导入微生物细胞原核生物的特点原核生物的特点: :繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少。繁殖快，多为单
9、细胞，遗传物质相对较少。大肠杆菌的转化过程大肠杆菌的转化过程: :用用CaCa2+2+处理细胞处理细胞 增加细胞壁的透性，增加细胞壁的透性，与细胞膜无关与细胞膜无关三、目的基因导入受体细胞三、目的基因导入受体细胞 感受态细胞感受态细胞重组表达载体重组表达载体DNADNA分子与感受态细胞混合分子与感受态细胞混合感受态细胞吸收感受态细胞吸收DNADNA分子分子22页，共34页，星期二。四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定1 1、导入目的基因后需要检测哪些方面？各、导入目的基因后需要检测哪些方面？各采取什么方法？采取什么方法？2 2、什么是、什么是DNADNA分子探针？检测时的分子探针？
10、检测时的DNADNA探针探针通过什么原理来检测目的基因和相应的通过什么原理来检测目的基因和相应的mRNAmRNA？3 3、利用抗体抗原杂交检测的原理是什么、利用抗体抗原杂交检测的原理是什么？23页，共34页，星期二。目的基因的检测内容和方法目的基因的检测内容和方法四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定1目的基因插入目的基因插入2目的基因是否表达目的基因是否表达24页，共34页，星期二。DNA分子杂交技术分子杂交技术基因探针：核酸分子探针是指特定的已知核酸基因探针：核酸分子探针是指特定的已知核酸片段，能与互补核酸序列退火杂交，用于对待片段，能与互补核酸序列退火杂交，用于对待测核酸样品中
11、特定基因顺序的探测。测核酸样品中特定基因顺序的探测。满足：（满足：（1）必须是单链，（）必须是单链，（2）带有容易）带有容易被检测出来的标记物。被检测出来的标记物。25页，共34页，星期二。3.在遗传工程技术中在遗传工程技术中,下列何种目的基因一般以直接分离的方法获得下列何种目的基因一般以直接分离的方法获得()A.人的胰岛素基因人的胰岛素基因B.蚕的蚕丝蛋白基因蚕的蚕丝蛋白基因C.芽孢杆菌的抗虫基因芽孢杆菌的抗虫基因D.菜豆储藏蛋白基因菜豆储藏蛋白基因4.1976年年,美国的科学家首次将人的生长抑制素释放因子的基因美国的科学家首次将人的生长抑制素释放因子的基因转移到大肠杆菌转移到大肠杆菌,并获
12、得了表达并获得了表达,此文中的表达是指该基因在大肠杆此文中的表达是指该基因在大肠杆菌菌()A.能进行能进行DNA复制复制B.能传递给细菌后代能传递给细菌后代C.能合成生长抑制素释放因子能合成生长抑制素释放因子D.能合成人的生长素能合成人的生长素26页，共34页，星期二。3.基因工程是在基因工程是在DNA分子水平上进行设计施分子水平上进行设计施工的工的,在基因操作的基本步骤中在基因操作的基本步骤中,不进行减基不进行减基互补配对的步骤是互补配对的步骤是()A.人工合成目的基因人工合成目的基因B.目的基因与载体结合目的基因与载体结合C.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞D.目的基因的检测和
13、表达目的基因的检测和表达27页，共34页，星期二。基因工程同步测验一、选择题一、选择题(每项只有一个正确答案每项只有一个正确答案)1下列有关限制性核酸内切酶的说法，正确的是下列有关限制性核酸内切酶的说法，正确的是A限制酶主要是从真核生物中分离出来的限制酶主要是从真核生物中分离出来的B限制酶的识别序列只能由限制酶的识别序列只能由6个核苷酸组成个核苷酸组成C限制酶能识别双链限制酶能识别双链DNA分子的某种特定的核酸分子的某种特定的核酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开间的磷酸二酯键断开D限制酶切割产生的限制酶切割产生的DNA片段末
14、端都为黏性末端片段末端都为黏性末端28页，共34页，星期二。基因工程同步测验2有关基因工程叙述正确的是有关基因工程叙述正确的是()A限制酶只在获取目的基因时才用限制酶只在获取目的基因时才用B重组质粒的形成是在细胞内完成的重组质粒的形成是在细胞内完成的C只要目的基因进入细胞就能成功实现表达只要目的基因进入细胞就能成功实现表达D蛋白质的氨基酸排列顺序可能为合成目的基因蛋白质的氨基酸排列顺序可能为合成目的基因提供线索提供线索29页，共34页，星期二。基因工程同步测验3下图为下图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制性核酸内切酶、化，图中依次表示限制性
15、核酸内切酶、DNA聚合聚合酶、酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是连接酶、解旋酶作用的正确顺序是ABCD30页，共34页，星期二。基因工程同步测验4以下甲、乙两图表示从细菌细胞中获取目的基以下甲、乙两图表示从细菌细胞中获取目的基因的两种方法，以下说法中错误的是（因的两种方法，以下说法中错误的是（）A甲方法可建立该细菌的基因组文库甲方法可建立该细菌的基因组文库B乙方法可建立该细菌的乙方法可建立该细菌的cDNA文库文库C甲方法要以脱氧核苷酸为原料甲方法要以脱氧核苷酸为原料D乙方法需要逆转录酶参与乙方法需要逆转录酶参与31页，共34页，星期二。基因工程同步测验5目的基因导入受体细胞后，是否可以稳
16、定维持目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是道。下列属于目的基因检测和鉴定的是()检测受体细胞是否有目的基因检测受体细胞是否有目的基因检测受体检测受体细胞是否有致病基因细胞是否有致病基因检测目的基因是否转检测目的基因是否转录出录出mRNA检测目的基因是否翻译成蛋检测目的基因是否翻译成蛋白质白质ABCD32页，共34页，星期二。基因工程同步测验7、(11分分)(2012新课标全国卷新课标全国卷)根据基因工程的有关知识，回答下列问题：根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(1)限制性内切酶切割限制性内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有分子后产生的片段，其末端类型有_和和_。(2)质粒运载体用质粒运载体用EcoR切割后产生的片段如下：切割后产生的片段如下：AATTCGGCTTAA为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用除可用EcoR切割外，切割外，还可用另一种限制性内切酶切割，该酶必须具有的特点是还可用另一种限制
