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1、登革热实验室检测登革热实验室检测云南省寄生虫病防治所云南省寄生虫病防治所20142014年年1010月月概要概要n检测目的检测目的n检测对象检测对象n检测内容检测内容q实验室检测q复核检测n检测方法检测方法n样本采集、保存和运输样本采集、保存和运输检测目的检测目的n及时发现、诊断病例。n病毒分型和溯源。n为登革热流行趋势的预测、预警和制定防治对策、措施提供科学依据。检测对象检测对象n疑似和临床诊断病例（按照登革热诊断标准WS216-2008）。检测内容检测内容n实验室检测实验室检测q登革热疑似病例发生所在地医院和/或县（市）疾控机构采集病例血清，检测登革病毒抗原、核酸或抗体。登革热疑似病例实验
2、室检测流程检测内容n复核检测复核检测q送州/市CDC或云南省寄生虫病防治所的临床标本，抽样30%进行复核检测，疫点首发病例需采用病原学和/或双份标本血清学方法复核检测，暴发疫情复核检测不少于5例，疫情少于5例者应全部检测，病毒核酸阳性标本应分型检测。q疫点首发病例，重症病例、输入病例急性期标本应采用PCR方法进行分型检测，阳性者分离病毒，从临床标本或所分离病毒中扩增E蛋白编码基因，完成序列分析。q实验室检测阴性临床病例以及重症病例，应对恢复期血清进行IgM、IgG抗体和/或中和抗体检测。检测方法n病原学检测病原学检测q主要适用于急性期血液标本。1、抗原检测：一般发病后5天内血液标本NS1抗原检
3、出率高。标本中检出NS1抗原可以确诊病毒感染，适用于现场快速检测，可用于早期诊断2、核酸检测：一般发病后6天内血液标本病毒核酸检出率高。在病人血清中检出病毒核酸，可确诊而且能够分型，可用于早期诊断，但核酸检测容易因污染而产生假阳性，因此要求严格分区操作3、病毒分离：一般发病后5天内血液标本病毒分离率较高。将标本接种于蚊源细胞（C6/36）或哺乳动物细胞（BHK21、Vero）进行分离培养，出现病变以后，用检测抗原或核酸的方法鉴定病毒。分离到登革病毒可以确诊，但其耗时长，不适于快速诊断。检测方法n血清学检测血清学检测q主要适用于发病5天以后血液样本，但需注意可能与其他黄病毒感染发生交叉反应。1、
4、血清特异性血清特异性IgM抗体：抗体：采用ELISA、免疫层析等方法检测。IgM抗体阳性，提示患者可能新近感染登革病毒，适用于登革热早期诊断，但单份标本不能确诊2、血清特异性血清特异性IgG抗体：抗体：采用ELISA、免疫荧光（IFA）、免疫层析等方法检测。患者恢复期血清 IgG 抗体阳转或滴度较急性期呈4倍及以上升高可以确诊3、中和抗体：采用空斑减少中和实验、微量中和实验等方法检测，可用于分型。患者恢复期血清中和抗体阳转或滴度较急性期呈4倍及以上升高可以确诊。酶联免疫法检测登革病毒酶联免疫法检测登革病毒NS1抗原抗原 n检测仪器设备和材料检测仪器设备和材料q加样器、温箱、洗板机、含波长450
5、nm的酶标仪、登革病毒抗原检测试剂盒（酶联免疫法）酶联免疫法检测登革病毒酶联免疫法检测登革病毒NS1抗原抗原n操作步骤操作步骤1 、将试剂盒在冰箱中取出，放置室温平衡30分钟，使用前将试剂轻轻震荡混匀。2 、配液：将试剂盒中浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释。3 、编号：将样品对应微孔板编号，每板设阴性对照3孔，阳性对照2孔和空白对照1孔。4 、加稀释液：每孔加稀释液50L，空白孔除外。5 、加样：分别在相应孔加入待测样品或阴阳性对照各50L，空白孔除外。6、 温育：用封板膜封板后，置37温育60分钟。7 、每孔加酶标试剂50L，空白孔除外，轻轻震荡混匀。8、 温育：用封板膜封板后，置37温育30分
6、钟。9 、洗板：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干。10、显色：每孔加入显色剂A、B液各50L，轻轻震荡混匀，37避光显色15分钟。11、测定：每孔加终止液50L，10分钟内测定结果。设定酶标仪波长于450nm处（建议使用双波长450nm/600-650nm检测），用空白孔调零后测定各孔A值。酶联免疫法检测登革病毒酶联免疫法检测登革病毒NS1抗原抗原n结果判定结果判定1、 临界值计算：临界值=0.10+阴性对照孔A值均值（阴性对照孔A值低于0.05者以0.05计算）。2 、阴性对照的正常值范围：阴性对照孔A0.1（若1孔A大于0.1应舍弃，若两孔或两孔以上阴性对照大于0.1，应
7、重复实验）。3 、阳性对照正常值范围：A0.8.4、阳性判定：样品A值临界值者为登革病毒抗原阳性。5、阴性判定：样品A值临界值者为登革病毒抗原阴性。n意义意义q结合临床信息，阳性结果可以诊断为登革病毒感染，但阴性结果并不排除登革病毒感染的可能。胶体金免疫层析法检测登革病毒胶体金免疫层析法检测登革病毒NS1抗原抗原 n检测仪器设备和材料检测仪器设备和材料q加样器、登革热病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）n检测步骤检测步骤1 、将试剂盒和待检样本自冰箱中取出平衡至室温。2 、当准备好测试时，打开密封的铝箔袋，取出检测卡，平放于水平桌面上。3 、在检测卡上标记病人的样本号。4 、加样：用滴管从样本中取1
8、滴（约30-45L）血清或血浆标本，加于检测卡/条上的加样区内，另外加1滴（约30-45L）稀释液，保证操作过程中没有气泡产生。（如果加样后30秒钟，没有看到样本移动，可能是由于样本太黏稠，可在样本加样孔内再加1滴样本稀释液。5、 加入样本后20-25分钟内判读结果，并将结果拍照。胶体金免疫层析法检测登革病毒胶体金免疫层析法检测登革病毒NS1抗原抗原 n结果判定结果判定1 、阴性结果：仅质控线C出现肉眼可见条带。2 、阳性结果：质控线C和检测线T均出现肉眼可见条带。3 、无效结果：未肉眼可见的质控线C4 、质量控制：如遇下列情况，请按上述操作步骤使用实验室备用的阳性和阴性样本对该批产品进行质量
9、控制： 4.1 、新检验员使用本产品。 4.2 、使用新批号产品。 4.3 、试剂卡储存温度在2-30以外。 4.4 、测试区温度在2-30以外。n9 意义意义q阳性结果说明检测到登革病毒抗原，结合临床可以诊断为登革病毒感染；阴性结果说明没有检测到登革病毒抗原，但不能排除登革病阴性结果说明没有检测到登革病毒抗原，但不能排除登革病毒感染。毒感染。NS1快速诊断卡的使用NS1快速诊断卡的使用NS1快速诊断卡的使用NS1快速诊断卡的使用IgM捕捉捕捉ELISA法（法（MacELISA）检测登革）检测登革热热IgM抗体抗体n检测仪器设备和材料检测仪器设备和材料q加样器、温箱、洗板机、含波长450nm的
10、酶标仪、登革病毒IgM抗体检测试剂盒，或实验室自备材料：1 、抗原：q阳性抗原：采用C6/36细胞感染登革病毒培养物为阳性抗原。q阴性抗原：未接种病毒的正常C6/36细胞为阴性抗原对照。2、抗人IgM（链）单克隆抗体或多克隆抗体；3、登革病毒IgM阳性、阴性对照血清；4、辣根过氧化物酶标记登革病毒单克隆抗体；5、缓冲液：q洗涤液：pH7.4 PBST（0.05吐温20）；q稀释液：pH7.4 PBS（5牛血清）；q封闭液：pH9.6 碳酸缓冲液（1牛血清白蛋白）；6、显色液：A/B液7、终止液：4N H2SO4IgM捕捉捕捉ELISA法（法（MacELISA）检测登革）检测登革热热IgM抗体抗
11、体n检测步骤检测步骤1、 用稀释液按效价稀释抗人链单克隆抗体，100l/孔，加盖，4过夜；2 、弃去抗人链，用洗涤液重复洗3次，甩干，加封闭液，100l/孔，置37水浴孵育2小时；3 、弃封闭液，用洗涤液重复洗3次，甩干。4 、将待检血清用稀释液从1：10开始作2或4倍连续稀释，加入酶标板孔中，100l/孔，同时加入已1：10稀释的阳性血清、阴性血清对照各4孔，100l/孔，置37水浴孵育2小时；5 、弃去血清，用洗涤液重复洗3次，甩干，分别加4个型DV抗原及阴性抗原对照，100l/孔，4过夜；6 、弃抗原，用洗涤液重复洗3次，甩干，加用稀释液稀释至工作浓度的相应的登革热酶标单克隆抗体，正常抗
12、原加4个型混合的酶标单克隆抗体，100l/孔，37水浴2小时；7 、弃去标记物，用洗涤液重复洗3次，甩干，于各反应孔内加A/B液各一滴，37，避光35分钟；8 、加终止液于每反应孔，一滴/孔。IgM捕捉捕捉ELISA法（法（MacELISA）检测登革）检测登革热热IgM抗体抗体n结果判断结果判断1、目测方法：q阳性对照孔呈明显蓝色，阴性对照孔呈无色，对照成立；若待检血清孔呈明显淡蓝色或深蓝色（TMB），则标本为登革热IgM抗体阳性，反之阴性。2、酶联免疫检测仪检测：q于450nm（TMB）阳性对照孔OD值/阴性对照孔OD值，即P/N2.1，对照成立；若待检血清孔OD值与阴性对照孔OD比值2.1
13、，则标本为登革热IgM抗体阳性，反之阴性。（阴性对照孔OD值小于0.05按0.05记，若大于0.05按实际数值计算）酶联免疫法检测登革病毒酶联免疫法检测登革病毒IgG抗体抗体n检测仪器设备和材料检测仪器设备和材料q加样器、温箱、洗板机、含波长450nm的酶标仪、登革病毒IgG抗体检测试剂盒，或实验室自备材料：1 、抗原：q阳性抗原：采用C6/36细胞感染登革病毒培养物为阳性抗原。q阴性抗原：未接种病毒的正常C6/36细胞为阴性抗原对照。2 、辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体；3 、缓冲液：q包被液：pH9.6碳酸缓冲液；q稀释液：pH7.4 PBS（含5%脱脂奶）q洗涤液：pH7.4 PBS
14、T（0.05吐温20）；4 、显色液：A/B液5 、终止液：4NH2SO46 、酶标板、酶标仪。酶联免疫法检测登革病毒酶联免疫法检测登革病毒IgG抗体抗体n检测步骤检测步骤1、 用包被液按工作浓度稀释抗原，100l/孔，4过夜；2 、弃去包被液，用PBS-T重复洗涤35次，甩干；3 、将待检血清用稀释液从1：100开始作2或4倍连续稀释，加入抗原孔，100l/孔，同时设阴、阳性对照，37水浴1小时；4 、弃去血清，用洗涤液洗涤56次；5 、加酶结合物，用稀释液按工作浓度稀释，100l/孔，37水浴1小时；6 、弃去酶标抗体，用洗涤液洗涤6次，甩干；7 、加显色液：于各反应孔内加A/B液各一滴，
15、37，避光35分钟；8 、加终止液于每反应孔，100l /孔。酶联免疫法检测登革病毒酶联免疫法检测登革病毒IgG抗体抗体n 结果判断结果判断q于450nm（TMB）阳性对照孔OD值/阴性对照孔OD值，即P/N2.1，对照成立；若待检血清孔OD值与阴性对照孔OD比值2.1，则标本为登革热IgG抗体阳性，反之阴性。（阴性对照孔OD值小于0.05按0.05记，若大于0.05按实际数值计算）n意义意义q阳性结果，表明曾受到DV感染；恢复期血清抗体阳转，或抗体滴度比急性期抗体滴度有4倍及以上升高则可确诊。免疫荧光法检测登革病毒免疫荧光法检测登革病毒IgG抗体抗体n检测仪器设备和材料检测仪器设备和材料1、
16、 DV14型抗原片：DV标准毒株感染VERO或BHK21细胞制备，低温干燥保存；2 、对照：登革热患者恢复期血清（阳性对照），非登革热患者血清阴性对照)；3 、羊抗人（或兔抗人）IgG荧光素标记抗体；4 、常用稀释液：pH7.27.4PBS、伊文思兰等；5 、荧光显微镜。免疫荧光法检测登革病毒免疫荧光法检测登革病毒IgG抗体抗体n检验步骤：检验步骤：1 、用pH7.4，0.02mol/L PBS稀释待检血清，从1:20开始做2倍连续稀释至需要的稀释度。2 、取出抗原片，用蒸馏水漂洗后，风干。3 、用加样器依次从高稀释度到低稀释度逐个加入已稀释的待检血清，加入量以覆盖细胞抗原面为准（若为双份血清，最好上排为急性期血清，下排为恢复期血清），在37水浴箱湿盒孵育30分钟（每次试验同时设阳、阴性对照）。4 、用PBS震荡洗涤3次，每次5分钟，再用蒸馏水洗涤1次脱盐，风干。5 、用含1：3万的伊文思兰PBS按工作浓度稀释荧光结合物，滴加各孔（以覆盖细胞抗原面为准），在37 水浴箱湿盒孵育30分钟，然后同（4）洗涤、漂洗、吹干。6 、荧光显微镜观察结果。免疫荧光法检测登革病毒免疫荧光法检测登革病毒
