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1、泰乐菌素发酵生产泰乐菌素发酵生产改良办法改良办法主要内容主要内容泰乐菌素介绍泰乐菌素介绍改良的基本途径改良的基本途径选育改良的具体目标选育改良的具体目标总述总述抗生素的发现抗生素的发现青霉素能抑制其周围葡萄球菌的生长；链霉菌对顽固的结核杆菌有明显抑制作用 。拮抗作用：一类微生物抑制或杀死它类微生物的作用。1.抗生素介绍抗生素介绍一、一、泰乐菌素介绍泰乐菌素介绍抗生素的概念：抗生素的概念：抗生素是指微生物在代谢过程中产生的，在低浓度下就能抑制它种微生物的生长和活动，甚至杀死它种微生物的化学物质。来源来源: 微生物，高等动、植物产生的代谢物，化学方法合成或半合成的化合物。性能：性能：抗细菌、抗肿瘤
2、、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫、杀虫除草等。2. 2. 泰泰乐菌素介菌素介绍泰乐菌素泰乐菌素( Tylosin)：又名泰乐星，泰洛霉素，为大环内酯类抗生素，它对支原体抗性最强，低毒广谱，可用于治疗由耐青霉素细菌引起的感染，主要抗G +，对大部分G - 、螺旋体、大病毒也有作用。产生菌有弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae, NRR2702, 2703) ，龟裂链霉菌( S. rim osns )和吸水链霉菌( S.hygro - scop icus) 。工业生产多利用新霉素链霉菌。合成：合成：泰乐菌素内酯环是由五个丙酸、二个乙酸和一个丁酸组成,内酯环上再依次连上6 - 脱氧- D
3、- 阿洛糖 (M yc inose),碳霉氨基糖(M ycam inose) 和红霉糖(碳霉糖,M yca rose) 。以上三个糖均来自葡萄糖, N -上两个甲基及2及3上的两个甲基来自甲硫氨酸。发酵酵：发酵过程中，同时存有4个组份，分别是泰乐菌素A，去碳霉糖泰乐菌素B、大菌素C及雷洛菌素D。发酵初期生物合成以泰乐菌素A 为主，随着发酵周期的延长，A组份与C组份比例发生转化，A 组份相对减少，C组份相应升高。由于A 组份具有最强的生物活性，发酵后期, 需将C组份向A 组份定向转化，使A 组份含量达80% 以上，方能放罐，组份A 与组份C 结构之间的差别，主要是R2基的不同，要使组份C转化为组
4、份A，必须促使组份C进行甲基化反应，必须有大菌素C甲基转移酶的促进作用。二、育种二、育种改良的具体目标改良的具体目标(1)提高产量。提高产量。(2) 提高产物的纯度提高产物的纯度，减少副产减少副产物物；提高有效组分提高有效组分 。(3) 改变菌种性状改变菌种性状。(4) 使种的遗传性状使种的遗传性状，特别是生特别是生产性状稳定。产性状稳定。(5) 改变生物合成途径改变生物合成途径，以获得以获得新产品。新产品。三、改良的基本途径三、改良的基本途径 最常用的菌种改良手段是诱变及筛选。随着对抗生素生物合成途径及其相关基因的分子生物学研究的深人， 抗生素育种技术结构将会逐步转向以基因工程技术为主的多样
5、化的育种结构方式。国内外采用多种方式提高泰乐菌素生产产量，介绍如下：（1）传统的诱变及筛选传统的诱变及筛选（2）发酵过程改良发酵过程改良（3）基因重组基因重组（4）基因工程技术基因工程技术 传统的诱变及筛选是最常用的菌种改良手段。菌种选育的第一步工作就是利用自发突变进行自然选择。所谓自然选择就是从一个菌种的群体中,不经过任何诱变因素处理, 利用自发突变直接选择所需要的变种。目前许多新抗生素的生产菌种的选育也以自然选择为开端。1.传统的诱变及筛选传统的诱变及筛选新诱变因子及诱变技术的开发：新诱变因子及诱变技术的开发：新的诱变剂- 低能离子束（离子注入是20 世纪80 年代兴起的一种表面处理技术）
6、。近年来，激光辐射诱变和微波电磁辐射诱变亦颇受注意。多年来为提高诱变效率,育种工作者在诱变方法上作了不少改进。其中尤以原生质体诱变的效果比较突出。诱变时增变因子(助变剂) 等的作用自然选择的目的:纯化原种稳定生产巩固变种和杂种的特性提高产量。 诱变是用物理、化学或生物的诱变因子修改目的微生物的基因组，产生突变型。在实践中也还有用抗生素作为诱变剂的实例。诱变育种包括个环节以合适的诱变方法处理大量而分散的微生物细胞悬浮液, 在引起绝大多数细胞致死的同时, 使存活个体中的变异频率大大提高设计一种有效的筛选方法淘汰负变株, 并把正变株中少数变异幅度最大的具有优良性状的菌株巧妙地挑选出来。3.发酵过程改
7、良发酵过程改良碳源、PH控制泰乐菌素的发酵以豆油为主要碳源。若分化期发酵中存在过量的葡萄糖，则促进ATP水平的上升，从而抑制泰乐菌素的生长，而豆油中的油酸、亚油酸经过甲基化形成甲基油酸，它是泰乐菌素的前体物质，能促进其生物合成。 细胞内ATP水平对抗生素生产的影响 细胞内ATP水平的控制对抗生素生产也很重要。为进行抗生素生物合成，必须使产生期中细胞内ATP保持低水平。弗氏链霉菌NRRL2702生物合成泰乐菌素与细胞内腺苷酸（ATP、ADP、AMP）浓度有关系。据研究, 在发育迅速的阶段(2天)ATP及ADP的细胞内浓度达到最高值, 然后在泰乐菌素合成刚要开始之前下降。产生期腺苷酸总量迅速下降,
8、 结果使泰乐菌素的生物合成受到抑制。表明ATP浓度或腺苷酸水平或此两者都是调节泰乐菌素生物合成开始的细胞内作用物。 油脂的作用 在脂肪水解酶的作用下分解为甘油和脂肪酸，脂肪酸通过-氧化产生大量乙酰CoA，为泰内酯的合成提供大量的乙酸单位，并通过推动TCA 循环或乙醛酸循环，由这些循环的中间产物草酰乙酸，琥珀酰CoA在甲基丙二酰CoA羧基转移酶和甲基丙二酰CoA异构酶的作用下形成甲基丙二酰CoA和丙酰CoA，为泰内酯的合成提供大量的丙酸单位，从而有利于泰乐菌素的合成。PH的控制豆油含量低，不利于菌丝生长，而含量过高，则不能完全利用， 产生脂肪酸积累, 造成PH值下降，由此可能抑制了大菌素C甲基转
9、移酶的活性，影响了组份含量。关于泰乐菌素组份转化的机制，其关键酶大菌素C甲基转移酶的活性是一促进因素，而pH的控制对此酶的活化起着保证作用。因此，在发酵过程中，主要以补加豆油来满足产生菌对碳源的需要，而严格控制豆油的加量，是发酵成败的关键。对碳源、PH的控制，可以保证发酵的产量。发酵过程中，pH 的变化对于预测发酵液组份具特征性指标意义，它可以是进行工艺设计和反馈调控的依据之一。培养温度控制在泰乐菌素发酵过程中,在不同的发酵阶段控制不同的最适培养温度,采取变温培养的方式,可以提高发酵单位,增加泰乐菌素产量。添加氧载体通过添加氧载体如正十二烷、全氟化碳等, 提高发酵系统中的氧传递速度, 从而促进
10、了泰乐菌素的生物合成。当加人5%的正十二烷或全氟化碳, 泰乐菌素的生成量分别提高14%和8%。通过加入氧载体, 改善泰乐菌素发酵系统的供氧能力, 以提高菌体的产素能力。泰乐菌素发酵是以植物油为碳源，油脂类为底物时, 需消耗较多的氧，当供氧能力提高后,可以提高产素能力。其原因是氧载体的加人增大了油水间的界面积, 提高了溶解氧与底物的传递速度, 进而提高了菌体的产素能力。菌株的选育及其培养条件的优化 通过对泰乐菌素产生菌弗氏链霉菌BMB-012进行复壮，获得发酵效价相对较高的菌株A-49。依次进行紫外线氯化锂复合诱变等多种诱变，筛选得到高产菌株S-22。对发酵培养基配方进行了单因子实验，对发酵培养
11、基主要组分进行正交实验。为了进一步提高泰乐菌素的发酵效价，采用BP神经网络结合遗传算法的方法对发酵培养基中的菜油、鱼粉D、甜菜碱盐酸盐、组份X这四种组份进行优化。优化后的培养基使泰乐菌素的发酵效价比采用正交优化的培养基SH1提高了。3. 基因重组基因重组基因重组是菌种改良的另一重要途径，手段包括：(1) 杂交育种杂交育种(2) 准性重组育种准性重组育种(3) 原核生物的基因重组原核生物的基因重组接合、接合、转化和转导等转化和转导等(4) 原生质体融合技术原生质体融合技术由于原生质体融合技术具有很多优点, 为遗传育种提供了一种有效手段,所以不论是方向性还是自觉性, 原生质体融合技术均比诱变育种前
12、进了一大步, 而且可以消除某一菌株在诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象。国外采用原生质体融合及基因工程等新技术进行育种,使菌种生产能力大大提高,目前发酵单位已达16000u /ml。逐步建立起来的基因工程技术, 使基因或一些具有特殊功能的片段的分离变得十分容易。由于链霉菌是合成天然抗生素的最重要的生物, 因此基因工程育种技术在链霉菌中应用最为广泛。4.基因工程技术基因工程技术泰乐菌素生物合成基因的克隆Hershberge等报道，人工合成生物合成酶的部分氨基酸序列，并以此作为探针，从组建的基因文库中检测抗生素合成基因，采用这种方法，克隆了泰乐菌素生物合成基因。人工构建的生物合成基因DNA 片断
13、能在许多链霉菌中表达，产生泰乐菌素。分子改造与育种（提高菌种转化泰乐菌素能力）BIB0830是将泰乐菌素转化为乙酰异戊酰泰乐菌素(AIV)的耐热链霉菌工业菌株。以pIJ8600为载体分别构建了acyB1-B2基因整合型表达载体pBIB425。通过大肠杆菌(Escherichia coli)-链霉菌属间接合转移分别将pBIB425导入工业菌株BIB0830,抗性筛选分别得到接合子BIB425。经PCR验证均阳性克隆。摇瓶发酵结果表明,与出发菌株BIB0830相比,BIB425泰乐菌素转化率提高了22%。 随着对泰乐菌素结构和疗效研究的深入，国内外通过生物转化和化学合成的手段, 生产出一系列泰乐菌素的衍生物。这些衍生物在药效上大大高于泰乐菌素, 在药物残留方面比泰乐菌素表现出很大的优势, 有逐渐取代泰乐菌素的趋势。 目前，随着原生质体融合技术的进一步发展以及农用抗生素基因学研究的深入,农用抗生素育种技术结构将会转向以诱变育种为基础，原生质体融合及分子育种技术为主的多样化的育种结构方式，尤其是分子育种技术的进步必将促进农用抗生素高产菌株选育的飞速发展。
