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1、第2节动物细胞培养一 动物细胞培养从社会中来在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤來源又不足，而且会产生免疫排斥反应。那么，怎样才能获得大量的自体健康皮肤?能不能用自体皮肤的单个细胞培养出可供移植的皮肤?通过细胞培养构建的人造皮肤一 动物细胞培养一、动物细胞培养1动物细胞工程常用技术动物细胞培养、动物细胞融合和动物细胞核移植等。(1)常用技术：(2)基础：动物细胞培养。2动物细胞培养(1)概念：从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。(2)培养条件营养
2、属于合成培养基将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养基。需加入天然成分：血清。是液体培养基，即培养液无菌、无毒的环境a对培养液和所有培养用具进行灭菌处理。b在无菌环境下进行操作。c培养液需定期更换，以清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。a.成分： 糖类、氨基酸、无机盐、维生素等。b.类型：温度、pH和渗透压a温度：以36.5 0.5 为宜。bpH：以pH为7.27.4为宜。c适宜的渗透压:气体环境O2作用： 细胞代谢所必需的。CO2主要作用： 维持培养液的pH。a动物细胞培养所需气体主要有O2和CO2。b在进行细胞培养时，通常采用培养皿或松盖培养瓶， 并将它们置于含
3、有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中进行培养。培养皿培养瓶CO2培养箱维持细胞正常的形态和功能(3)原理：细胞增殖（有丝分裂）(4)培养过程体外培养的动物细胞类型悬浮在培养液中生长增殖的细胞过程动物组织块用机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理分散成单个细胞问题细胞分裂受阻悬浮生长贴壁生长原因原因细胞密度过大、有害代谢物积累和营养物质缺乏等接触抑制解决传代培养制成细胞悬液原代培养分瓶原代培养：指动物组织经处理后的初次培养。细胞贴壁：悬液中分散的细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上。接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞停止分裂增殖的现象。传代培养：分瓶后的细胞培养。单层贴壁的猪
4、输卵管上皮细胞贴附于某些基质表面生长增殖的细胞有关动物细胞培养的问题1.幼龄动物的细胞与老龄动物的细胞比较，分化程度低的细胞与分化程度高的细胞比较，哪些细胞更易于培养?为什么?幼龄动物的细胞和分化程度低的细胞更易培养，原因是这些细胞分裂能力强。2.动物细胞培养时，除了添加糖类、氨基酸等必要的营养成分外，往往还需添加血清等一些天然成分。为什么？人们对细胞所需的营养物质尚未全部研究清楚，血清等一些天然成分的营养成分比较齐全，可以弥补人工培养基的不足。3进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是什么？用胃蛋白酶可以吗？为什么蛋白质；不可以；多数动物细胞生存的适宜pH为7.27.
5、4，胃蛋白酶(适宜pH为1.5左右)在此环境中没有活性，而胰蛋白酶在此环境中活性较高，因此胰蛋白酶适用于细胞培养时的处理。有关动物细胞培养的问题1动物细胞培养的相关处理(1)使细胞分散开的原因：一是能保证细胞所需要的营养供应；二是能保证细胞内有害代谢物的及时排出。(2)使用胰蛋白酶时，要控制好作用时间，因为胰蛋白酶不仅能分解细胞间的蛋白质，长时间作用还会分解细胞膜蛋白等，对细胞造成损伤。进行动物细胞培养时不能用胃蛋白酶分散细胞，主要是因为pH不合适。核心归纳(3)动物细胞的整个培养过程中可能多次用到胰蛋白酶或胶原蛋白酶，第一次使用的目的是使组织细胞分散开；贴壁细胞传代培养时使用的目的是使细胞从
6、瓶壁上脱离下来，分散成单个细胞，便于分瓶后继续培养。(4)悬浮生长细胞：原代培养分裂受阻离心法收集制成细胞悬液传代培养。贴壁生长细胞：原代培养分裂受阻胰蛋白酶处理离心法收集制成细胞悬液传代培养。核心归纳核心归纳2植物组织培养与动物细胞培养的比较比较项目植物组织培养动物细胞培养原理植物细胞的全能性细胞增殖培养基固体培养基液体培养基过程外植体 脱分化愈伤组织 再分化芽、根或胚状体 生长发育植物体动物的组织机械法或酶细胞悬液原代培养细胞悬液传代培养结果新的植株新的细胞培养基特有成分蔗糖、植物激素葡萄糖、动物血清相同点两技术手段培养过程中都进行有丝分裂，都不涉及减数分裂；均需要无菌操作、无菌培养，需要
7、适宜的温度、pH等条件二、干细胞培养及其应用1干细胞的概念： 动物和人体内仍保留的少数具有分裂和分化能力的细胞。在一定条件下，干细胞可以分化成其他类型的细胞。2干细胞来源：早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中。3干细胞类型：胚胎干细胞和成体干细胞等。4胚胎干细胞(简称ES细胞)电镜下的胚胎干细胞(照片经后期人工上色处理，放大约1 500倍)(1)胚胎干细胞的分布： 存在于早期胚胎中(3)应用实例：具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细任何一种类型的细胞胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至甚至个体个体的潜能。(2)特点：ES细胞可在体外分化成心肌细胞、神经元、造血干细胞等。(4)局限性
8、：胚胎干细胞必须从胚胎中获取，这涉及伦理问题，因而限制了它在医学上的应用。5成体干细胞(1)分布： 成体组织或器官内的干细胞。(2)类型(3)特点： 具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。骨髓中的造血干细胞睾丸中的精原千细胞神经系统中的神经千细胞(4)作用：有着自我更新能力及分化潜能的干细胞，与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关。(5)应用造血干细胞：治疗白血病、一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病。神经干细胞：治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病(如帕金森病、阿尔茨海默病等)。6诱导多能干细胞(1)概念：通过体外诱导成纤维等细胞
9、，获得类似胚胎干细胞的一种细胞，被称为诱导多能干细胞(简称iPS细胞)。取成纤维细胞等取成纤维细胞等转入相关因子转入相关因子细胞发生转化细胞发生转化神经元神经元iPSiPS细胞细胞血细胞血细胞胰岛细胞胰岛细胞移植移植分化分化肠上皮细胞肠上皮细胞肝细胞肝细胞心肌细胞心肌细胞(2)应用治疗小鼠的镰状细胞贫血；现在用iPS细胞治疗阿尔茨海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展。(3)优点：无需破坏胚胎；iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。第2节动物细胞培养二、动物细胞融合技术与单克隆抗体一、动物细胞融合技术1概念：使两个或多个动物细胞结合形成一
10、个细胞的技术。2原理：细胞膜的流动性3诱导融合的方法PEG融合法电融合法灭活病毒诱导法4.结果：形成杂交细胞。融合后形成的杂交细胞具有原来两个或多个细胞的遗传信息。 用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程细胞核病毒颗粒细胞核灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但不破坏它们的抗原结构。5意义：细胞融合技术突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。6应用(1)成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。(2)用于制造单克隆抗体。动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较动物细胞融合
11、与植物体细胞杂交的比较比较项目植物体细胞杂交动物细胞融合原理细胞膜的流动性、细胞的全能性细胞膜的流动性步骤酶解法制备原生质体，诱导原生质体融合，形成杂种细胞，再经植物组织培养形成杂种植株分散成单个细胞后诱导细胞融合，形成杂交细胞方法聚乙二醇(PEG)融合法、高Ca2高pH融合法、电融合法、离心法PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法结果形成杂种植株形成杂交细胞，以生产细胞产品意义打破生殖隔离，实现远缘杂交育种突破有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能核心归纳二、单克隆抗体及其应用1传统抗体的获得(1)方法：向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需抗体。(2)缺陷： 产量
12、低、纯度低、特异性差。(1)制备原理B淋巴细胞特点：一种B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，B淋巴细胞在体外不能无限增殖。骨髓瘤细胞（癌细胞）特点：能在体外大量增殖，但不能产生抗体。2单克隆抗体的制备杂交瘤细胞特点：B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合得到的杂交瘤细胞，既能大量增殖，又能产生足够数量的特定抗体。动物细胞培养单克隆抗体杂交瘤细胞既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体骨髓瘤细胞（癌细胞）能在体外无限增殖一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体动物细胞融合杂交细胞(2)制备过程用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞。注射特定的抗原培养骨髓瘤细胞多种B淋巴细胞骨髓瘤细胞多种
13、杂交细胞诱导融合将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合用特定的选择培养基进行筛选:在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。对上述经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。抗体检测呈阳性的杂抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞交瘤细胞( (分泌的抗分泌的抗体能与特定抗原结合体能与特定抗原结合) )杂交瘤细胞(既能迅速大量增殖，又能产生抗体)从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量的单克隆抗体。单克隆抗体多种杂交细胞(2)制备过程注射到小鼠腹腔内体外培养将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞在体外条件下大规模培养，或注射到小
14、鼠腹腔内增殖。诱导融合的方法有哪些？注射抗原的目的是什么？大量增殖杂交瘤细胞获得单抗的方法多种B淋巴细胞小鼠注射抗原骨髓瘤细胞融合B-B细胞杂交瘤细胞 瘤-瘤细胞选择培养基 筛选1多种杂交瘤细胞符合要求的杂交瘤细胞体外培养小鼠腹腔内增殖单克隆抗体思考：思考：两次筛选的目的？抗原-抗体杂交法 筛选2克隆化核心探讨1给小鼠注射特定抗原的目的是什么？目的是能从该小鼠的脾中得到可以产生特定抗体的B淋巴细胞。2B淋巴细胞与骨髓瘤细胞经诱导融合后，培养基中共出现几种细胞？其中融合的细胞有几种？(如融合的话，只考虑两两融合)，诱导方法有哪些？共有5种细胞；其中融合的细胞有3种。诱导的方法：电融合法、PEG融
15、合法、灭活病毒诱导法3单克隆抗体制备过程中，第一次筛选的目的是什么？方法是什么？目的是筛选出杂交瘤细胞；方法是用选择培养基进行筛选。4单克隆抗体制备过程中，第二次筛选的目的是什么？方法是什么？其原理是什么？目的是筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞；方法是抗体检测；其原理是抗原抗体的特异性结合。比较项目第一次筛选第二次筛选筛选原因诱导融合后得到多种融合细胞，还有未融合的细胞等由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞筛选目的筛选出杂交瘤细胞筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞筛选方法用特定的选择培养基筛选；未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死
16、亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到足够数量的能分泌所需抗体的细胞单克隆抗体制备过程中两次筛选的比较核心归纳单克隆抗体的应用细胞凋亡ADC的作用机制示意图ADC被细胞吞噬ADC抗体药物接头(1)ADC的抗体和药物各具有什么作用?(2)除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物?抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞;药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。可以用放射性同位 素标记单克隆抗体进行靶向放疗。一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。(1)ADC的抗体和药物各具有什么作用?(2)除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物?抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞;药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。可以用放射性同位 素标记单克隆抗体进行靶向放疗。一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞
