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1、 酶消化法分离培养鼠牙胚间充质细胞 （1大庆油田总医院黑龙江大庆163001）（2佳木斯大学口腔医院黑龙江佳木斯154002）【摘要】目的从小鼠胎鼠的牙胚组织分离培养间充质细胞，鉴定其细胞特性。结论成功培养小鼠胎鼠牙胚间充质干细胞，体外稳定传代6代以上，有成为组织工程种子细胞的应用前景。【关键词】牙胚间充质细胞细胞培养牙乳头和牙囊由颅神经嵴细胞迁移分化而来，最终分化为成牙本质细胞、成牙骨质细胞和牙周成纤维细胞，是一类具有多向分化潜能的成体干细胞，具备作为牙组织工程种子细胞的应用前景。本研究从小鼠胎鼠下颌第一磨牙牙胚中分离外胚间充质细胞，酶消化法培养，鉴定其外胚间充质干细胞特性和分泌形成基质蛋白
2、能力，旨在为下一步在牙组织工程中的应用奠定基础。1材料和方法1.1材料DMEMF12培养基（D/F12）、胎牛血清（FBS）、鼠抗CD57/HNK-1单抗、鼠抗波形丝蛋白单抗，FITC荧光标记羊抗鼠IgG二抗。1.2方法1.2.1取材与培养1.2.1.1机械法分离胎鼠牙胚间充质1.2.1.2细胞培养方法酶消化法培养剩余之牙胚间充质剪切成0.5cm3大小组织块。37.5条件下2.5gL胰蛋白酶1mmolLEDTA消化2030min，不断振摇。血清中和并反复吹打后将细胞悬液经过100m细胞过滤器和3600rpm离心10分钟收集细胞。以培养液吹打成细胞悬液,调整细胞浓度为5105/ml后接种于培养瓶
3、中。37.5、5CO2、饱和湿度条件下培养，24天换液一次。细胞传代当细胞长满瓶底80时，弃培养液，37.5以2.5gL胰蛋白酶消化3min，培养液中和并吹打均匀，细胞计数，调整为5105/ml浓度后1：3传代。1.3观测指标1.3.1倒置显微镜观察细胞形态原代细胞贴壁后,每天在倒置显微镜下观察细胞形态，记录生长状况。1.3.2记录生长曲线并计算细胞倍增时间1.3.3免疫组化鉴定细胞表面标志1.3.4端粒酶活力测定2结果2.1细胞生长和形态观察原代细胞接种于培养瓶后，20min后即开始贴壁，4h后细胞开始铺展，24h后细胞铺展率34，细胞呈梭形和多角形，24个细胞突起，胞体丰满，单细胞核细胞居
4、多。812d后细胞可相互汇合铺满瓶底80，1：3消化传代后细胞形态与传代前基本一致。2.2生长曲线与细胞倍增时间细胞生长曲线呈“S”形，第35d细胞处于增殖期。经计算，酶消化法为2.360.34d。2.3细胞表面标志鉴定免疫细胞化学染色见培养细胞CD57/HNK-1、波形丝蛋白表达阳性，均为胞浆着色。2.4端粒酶活力测定端粒酶原位杂交显示部分细胞表达较高端粒酶活性，图像分析计数计算第3代细胞端粒酶表达比例为42.312.4。3讨论单纯胰蛋白酶消化牙胚，往往对牙胚细胞造成伤害。组织学实验证明，胰蛋白酶消化后的牙乳头不能继续发育，而胰蛋白酶EDTA消化的牙胚则不受影响。消化后牙胚上皮容易撕脱，即可
5、得到较完整的牙乳头和牙囊。实验中酶消化法第3代细胞纯度均可达到95以上，说明采用机械法分离较为彻底，可以基本去除上皮和下颌突间充质的干扰，能满足对牙胚间充质干细胞进一步研究的需要。端粒酶（Telomerase），在生殖细胞、干细胞和肿瘤细胞中高度表达，是这些细胞能够不断分裂增殖的主要原因。目前，85的恶性肿瘤细胞中已发现了端粒酶活性的表达，而与肿瘤相邻的正常组织细胞或良性病变中仅为4左右，同样的，在干细胞研究中也发现了端粒酶的高表达，某些细胞系表达率高达90以上。因此，端粒酶的功能活动决定了干细胞的生物学特点，端粒酶的表达可以反映细胞的增殖和自我更新能力，是干细胞的重要特点之一。本实验中，第3
6、代细胞端粒酶表达比例在42.3，明显高于正常组织中表达量，说明培养细胞中有较大量干细胞成分。本研究结果表明，采用机械法分离15.5日胎龄小鼠胎鼠下颌第一磨牙牙胚间充质，酶消化法培养，可以获得高纯度牙胚间充质干细胞。牙胚间充质干细胞为梭形或多角形，增殖能力活跃，均一性表达外胚间充质干细胞表面标志CD57HNK-1，同时表达波形蛋白，具有较高的端粒酶活性，原代培养形状稳定，有作为牙组织工程种子细胞的应用前景。参考文献1LiuW,CuiL,CaoY.AcloserviewoftissueengineeringinChina:theexperienceoftissueconstructioninimmunocompetentanimals.TissueEng.2003,9(Suppl1):S17-30.2ChaiY,SlavkinHC.Prospectsfortoothregenerationinthe21stcentury:aperspective.MicroscResTech.2003,60(5):469-79. -全文完-
