植物基因的克隆及策略

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1、植物基因的克隆及策略植物基因克隆的策略和方法穆兰(生物技术2班生命科学学院黑龙江人学哈尔滨150080)摘要：植物基因克隆是当前植物学研究的前沿和热点。经过二十年的发展，已经形成了 一些克隆植物基因的方法，主要冇功能克隆，PCR扩增，转座子或T-DNA标签，定位克 隆，差别杂交和减法杂交，mRNA差异显示和人工合成克隆。本文对这些技术的工作原理， 各白的优缺点及它们在植物基因克隆方而的应用现状和前景做一综述。关键诃：植物基因克隆策略进展Strategies and methods for cloning plant genesMu lan(The 2nd class of Biotechnol

2、ogy , College of Life Science, Heilongjiang University, Harbin,150080)Abstract: In the present, plant genes cloning was the front and focus in the field of botanty research . After the developmcnt of about twenty years, some methods for cloning was established , which included functional cloning, PC

3、R amplifying cloning , transposon or T-DNA tagging , positional cloning , differential hybridization and subtractive hybridization , mRNA differential display andartificial synthesis DNA cloning . In this paper, these techniques theory, advantages and disadvantages of each, as well as their applicat

4、ion prospects in cloning plant genes were introduced and discussedKey words: plant genes cloning strategy advance基因克隆就是利用体外重组技术将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中进行 扩增，它是随70年代初DNA体外重组技术发展而发展起来的。其H标是识别分离特 异基因并获得基因完整序列，确定染色体定位，阐明其生化功能并利用生物工程手段应 用到生产实践中去。通过几十年的努力，随着植物发育、生理生化、细胞学、分子 遗传学等学科的迅速发展，已经掌握了大量有关植物优艮性状基因的久物学

5、和遗传学特 征，并定位在染色体特定区域，再辅Z运用先进的酶学和生物学技术，特别是分了标 记、PCR扩增和DNA人工合成技术，已经克隆出了与植物抗病、抗除草剂、抗逆、抗 虫、育性、优质及植物发育相关的许多基因。植物基因克隆是当前植物学研究的前沿和热点之一，经过近20年的发展，已经形成了一些植物基因克隆的方法。本文综述口前 比较成熟的植物基因克隆策略和方法及取得的一些进展。1.功能克隆功能克隆(Functional cloning )就是从蛋白的功能着手进行基因克隆,是人类采用 的第一个克隆基因的策略。其基本内容为：根据已知的生化缺陷或特征确认与该功能有 关的蛋白质，分离纯化蛋白并测定出部分氨基酸

6、序列，根据遗传密码推测其可能的编 码序列，设计相应的核莒酸探针，杂交筛选cDNA文库或基因组文库，或考使用该蛋门 质特异的抗 体，筛选表达载体构建的cDNA文库。通过原抗体反应寻找特异的克隆， 最后对选中的克隆测序，获得口的基因的序列。用这一策略克隆基因的关键在于必须首先 分离出一个纯的蛋白，测定出其一部分氨基酸序列或得到和应抗体；其次要构建cDNA 文库或基因纽文库；然后要对文库进行杂交筛选。功能克隆只要知道目的基因表达的产物 即可，属于表型克隆范畴，但U前人多数基因产物还不清楚，即使知道了，要纯化到 可供氨基酸测序及抗体制备的蛋白质也很闲难，同时由于遗传密码的简并性，很难推导 出十分特异的

7、探针，所以大多数基因难以用这一方法予以克隆。2 PCR扩增克隆这是一种参考U知基因序列克隆基因的方法LI前很多植物基因序列已知，当要克隆类 似基因时可先从GenBank库中找到有关基凶序列，设计特界引物用PCR方法克隆不同 植物的基因o这是PCR技术诞生后岀现的一种快速、简便克隆植物基因的方法。王广立等根据所发表的10kD水稻醇溶蛋门基因序列，合成引物PCR扩增克隆到水稻 10RD醇溶蛋白基因。张晓国等以水稻DNA为模板PCR扩增到水稻花药特异表达基因启动 子0sg6B o分抗病基因R结构都极其相似，其亲和亮氨酸重复序列(L RR)和核廿酸结 合位点(NBS)区存在数个极为保守的结构域。根据R

8、基因这些结构特征，Seah等根 据小麦Cre3基因NBS - L RR区保守序列设计引物，从大麦和小麦中扩增到抗病基因 类似物(resistance gene analogs , R GAa )或候选抗病基因(candidate disease resistance genes)的基因片段，这些R GAa包含了和已知R基因相似的保守结构域， 它的氨基酸序列中有55 %59 %与小麦Cre3的NBS - L RR序列一致。冃前利用抗 病基因保守序列设计引物进行PCR扩增己在人豆、马铃黑、人麦、番茄、玉米和水 稻中克隆到许多与已知抗病基因同源的DNA序列。3. 转座子或T-DNA标签法转丿朋子(T

9、ransposon)是可从染色体的一个位置转移到另一位置的D N A片段， 最早在玉米种发现的，随后的研究表明，在牛物界中转座子是普遍存在的，并在半物的遗 传进化方而有巫要作用。转座子是对从基因的一个位置转移到另一位置的DNA片段， 它的插入可引起基因突变，当它割离后基凶功能又可恢复，因此对以将它作为一个插入 突变元来克隆因为转座子插入而失活的基因。当某基因的突变是由于转座子插入而造成 的，以转廉子DNA为探针就可从变异株的基因文库中筛选出带有此转座子的部分基因， 再以突变基因的部分序列作探针，即可从野生型文库中克隆出完整的基因。T-DNA标签法与转廉子标签法原理相似，只是前考的突变是由于T-

10、DNA的插入导致的。 利用T-DNA插入技术很早就得到了拟南芥的矮化突变体，利用这种技术Yanof sky克隆到 了一个花器官调节基因A Go由于该技术成功与否往往取决于能否筛选出转座因了插入的突变体，如在植物个体水 平上筛选，由于转座频率一般较低，通常要在104106个后代中筛选，工作量 大。近年来有人捉岀体细胞水平转座子标签法（somatic t ransposon tagging ），这 种方法基于原生质体培养和体细胞筛选，可以提高筛选效率，省吋省力。随着植物遗 传图谱日益饱和，把转朋子标签技术与遗传作图结合起來克隆基因将开辟转朋子标签技 术克隆异源植物基因的新天地。4. 差别朵交和减法

11、杂交高等植物人约含有10力个不同的基因，在发育过程中只有人约15 %的基因按特定时 间和空间有序的表达,这种方式即为基因的差别表达（differential expression）,差 别杂交和减法杂交都属于核酸杂交范畴，它特别适合于克隆经诱导表达的，在特定组织 中，特定发育阶段表达的基因或参与发育调节的基因。这两种方法克隆基因都必须要有两种不同的细胞群体，一种是FI的基因不表达（简称 -）,而另一种LI的基因正常表达（简称+ ）,然后制备两种不同的mRNA , 反转录制备两种cDNA探针，分别与表达冃的基因的cDNA文库进彳亍朵交筛选，选出只与 + 探针杂交而不与-探针杂交的克隆，这些可能为

12、特异表达的克隆。减法杂交 与差别杂交类似把+ cDNA与-mRNA进行过量杂交，除去+ 和- 细胞中共有产物形成的cDNA/ mRNA双链杂交分子，剩下保持单链的cDNA即为差异表 达的序列。尽管差别杂交和减法朵交在克隆基因方面广泛应用，但在实践中却存在诸多方面的局 限性，主要表而在：（1）灵敏度低，（2）重复性差。为提高克隆效率，常把这两 种方法结介起來使用，把由减法杂交得到的单链建立一个部分cDNA文库，则可以富集 所要寻找的特异序列，再对这样的文库进行差别杂交，不仅可以大大减少筛选的工作 量，而且灵敏度也得到提高。利用减法杂交也可以用来分离缺失突变基因，这项新技 术就是基因组相减后聚合酶

13、链式反应技术。应用此技术町在没有任何探针材料下克隆到R 的基因，其原理与减法杂交相似，只是通过反复多次和减后富集DNA片段，再用PCR 方法扩增所富集的片段并予以克降。5. 人工介成并克隆基因対一些基因长度比较短11 DNA序列已知的基因可用人工合成方法克隆它。Adang等用 人工合成方法合成了苏云金杆菌毒蛋白Bt基因。蒋红等根据蜘蛛杀虫肽的氨基酸序列， 利用植物密码子偏好性，人工合成并克隆了只有37个氨基酸的蜘蛛杀虫肽基因，并将 它转到烟草中去，以期产生抗虫作用。6 mRNA差别显示mRNA差别显示PCR是根据人多数真核细胞mRM的3端具有多聚核莒酸尾Pio汕结 构，因此可用含Oligo （

14、 d T ）的寡聚核幵酸作为引物将mRNA反转录成cDNA ,根据 PloyA序列起点前2个碱基除AA外只有12种可能性而设计合成了 12种下游锚定引物 5, - Til MN o利用3端锚怎引物与5Z端20种10bp随机引物构成的引物 对进行PCR扩增，能扩增出20 000条左右的DNA带，每一条带代表一种特定 mRNA ,这个数冃可人体涵盖一定发育阶段某种细胞中所表达的全部mRNA，通过比较品种 间的差异条带，则可得到口的基因。但DDR T - PCR成功前提是，相互比较的品种Z 间差界应尽对能小，否则真止有意义差杲表达的mRNA将淹没在人量的差界条带中无法区 分。它与差别杂交和减法朵交相

15、比具有明显优越性：（1）简便、快速、RXA用量少、 效率高。（2 ）由于应用了 PCR扩增技术使得低丰度的mRNA的鉴址成为可能，而且 灵敏度比较高。（3）可比较两种以上特定生理状态或不同发育阶段的细胞m-R7A样品间 基因表达的差异。该技术也已广泛应用于与植物胚胎发育、形态发生、信号传导、植 物抗逆、抗病、抗虫基因比较鉴定与克隆。但mRNA差显技术缺点也很多，主要有：（1 ）假阳性特别高，有时甚至高达85 % o （ 2 ）重复性差。（3 ）对高拷贝数mRNA有较强的倾向性，因此不能用于 反应低拷贝数的mRXA。（ 4 ）所得的特异片段仅为300bp左右，冃往往只是3端非翻译序列。（5） c

16、DNA片段扩增产物量不仅取决于mRNA的丰度，还取决于引物与模板之 间的匹配情况。基于mRNA差显技术的不足之处，许多学者都努力地改进它，主要有：减少锚定引物数量，减少工作量，增大重复性，提高 分辨率44 ;设计5Z端专用引物，降低G + C含量，提高扩增效率；PCR扩增 后的cDNA片段一半用丁保存，另一半克隆于表达载体中，把重组的表达载体与保存的 cDNA杂交，可挑选出阳性克隆,这样可有效去除假阳性；提高dN TP浓度及5,端随 机引物浓度，优化PCR反应的参数减少竟争性，增加灵敏性；把mRNA差显技术与RFL P、AFL P等技术相结合，这些大大改进了 mRNA差显技术的分辨率、精确度、有效 性及应用范围。7.定位克隆根据遗传分析将基因处位到染色体具体位置上，通过染色体步移不断缩小筛选区域而 克隆该基因的方法叫做基因定位克隆。它是克降编码产物未知基因的一种有效方法。定位克隆