棉花细胞的研究进展

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1、棉花细胞质雄性不育研究进展棉花是优质纤维、食用油和蛋口集一身的重要经济作物。如何提高棉花品种的产量、 品质和抗逆性并使其广泛应用于牛产是当前棉花育种岖需解决的问题。杂种优势的利用 则为这一问题的解决提供了新的思路，并已在很多植物中得到了广泛的应用。棉花具有十 分明显的杂种优势,但目前棉花杂种优势的利用则主要采用人工去雄授粉法和核不育系 “一系两用”法，方法繁琐且制种成本高，难以大规模推广应用。而水稻、高粱等作物则主 要采用细胞质雄性不育性(Cytoplasmic Male Sterility,CMS)实现“三系”配套来人面积利用 杂种优势的，操作简便且制种成本低。尽管棉花CMS己实现“三系”配

2、套,但山于其恢复源 狭窄及不育胞质对杂种1代皮棉产量所产生的负效应，“三系”杂种棉选育进展缓慢。随看 转谷胱廿肽S 转移酶基W(gst)强恢复系“浙大强恢”的育成以及海岛棉中育性增强基因的 发现，利用“三系”配套进行棉花大面积的杂种优势利用成为可能1。笔者从细胞学、生 理生化、分子生物学和育性恢复4个方面综述棉花CMS的研究进展，并对目前状况进行 了展望。1棉花CMS的细胞学研究植物雄性不育小抱了的败育时期各异,从花粉母细胞(Pollen Mother Cells,PMCs)的形 成到双核花粉粒各个时期都冇雄性不育发牛的可能，且持续时间比较长，不限于某一特定 的时间。对丁棉花CMS来说，小抱子

3、败育时期的发生主耍有3种惜况:主耍集中发牛于 造范细胞增殖时期。Murthi筹2对哈克尼两棉CMS进行细胞学研究的结果表明不育系 的雄性败育大多数发生在造孑包细胞增殖期，偶尔能形成PMCs,但在减数分裂的询期I就 退化，因此导致雄性不育。而Thomber等在美洲棉CMS系、黄晋玲等在晋A不育 系也发现同样的败育情况。主要集中发生于减数分裂时期。如王学徳等发现 104-7A、湘远4A、NM-2A和NM3A的小范子母细胞在造孑包细胞增殖时期较少异常, 但在减数分裂时期特别是减数分裂第1次分裂时期(Meiosis I )却大量败育，从而在花药 内见不到四分体的形成。败育时期贾穿造胞细胞堆殖至减数分裂

4、时期。童旭宏等6 发现來源于陆地棉新型CMS的败育时期主要发生在造他细胞增殖时期至小砲了母细胞 减数分裂前的时期。目前国内外人多数学者认为棉花胞质不育系花药绒毡层的过早退化或推迟解体与 造抱细胞和PMCs的败育密切相关。通过细胞学观察，棉花CMS小抱了败育过程中主要 出现的细胞形态特征为:造抱组织显常。如哈克尼西棉CMS系的造抱组织在发冇成熟 前就已解体2。细胞质和线粒体异常。如晋A不育系的人量小砲子母细胞在造孑包细 胞增殖期，细胞质大量液泡化，留下网状残体;线粒体处于解体状态，线粒体膜和内部结构 模糊,基质呈半透叨甚至透叨状态，内皤紊乱4h细胞核异常。如N M21A的小孑包子母 细胞在减数分

5、裂期,核仁穿壁频繁，出现23个微核多核细胞5。细胞形状异常。小孑何 子母细胞呈半刀形和网状形，且连成巨型团块5。染色体异常。在中期I出现落后染 色休单体,在后期I染色体不是集中于两极，而是凝结成若干个大小不一-的团块散布于两 极5。绒毡层过早退化或推迟解体。如晋A不育系的绒毡层细胞在造抱细胞增殖期 就过早退化6。2棉花CMS的生理生化研究正常的生理生化代谢是植物生长发育所需能量的皋础,而研究育性表达过程中的生 理牛化代谢对雄性不育的牛化机理探讨具冇重要的意义。目前已冇许多学者对棉花CMS 的一些牛理生化指标进行了大量的研究，取得了显苦成果。在碳水化合物方面,王学徳7 通过对中棉所12A及其保持

6、系中棉所12B的花药进行研究发现，从造砲细胞增殖期开始, 保持系可育花药随着发育可溶性糖含量逐渐下降，淀粉积累逐渐增多，特别在PMCs减数 分裂后，小他子发育至花粉成熟过程中有大量淀粉合成;相反,不育花药中的淀粉和可溶性 糖含量，从造孑包细胞增殖时期起一直处丁原来水平儿乎不变。可见,缺乏淀粉积累是引起 花药不育的巫要原因。在氨基酸方面,Servella等8首次报道了亚洲棉CMS花药中酸性 氨基酸含绘较低;在氨基酸组分中，不育系叶片中天门冬氨酸和精氨酸含量较高，而保持系 叶片中含量很少或完全缺失。随后王学德等9也在棉花不同CMS研究中发现了同样的 悄况。这说明氨基酸含量异常导致蛋白质合成受阻，从

7、而引起花药不育。在酶方面，黄晋 玲等10研究发现晋A不育系及其保持系的过氧化物酶同工悔和细胞色素氧化酶同工酶 存在明显的差异，这种差异产生的时期与其细胞形态学观察到的小抱了败育时期一致。这 说明雄性不冇基因调控了同工酶的形成与差显。在激索方面，解海岩等11用酶联免疫检 测技术对哈克尼西棉CMS、保持系、恢复系和杂种F1在花药发育时期内源激素含量的 动态变化进行研究，发现在保持系、恢复系和F1的可育花药之间内源激素差异不明显, 但在可育花药与不育系的不育花药间差异显着。在活性氧代谢方面,Jiang等12通过对哈 克尼西棉CMS、保持系和杂种Fl不同发育时期的花药进行活性氧指标及其清除酶含量 研究

8、发现,在不冇系败育初期的花药中，超氧阴离了(02-)、过氧化氢(H2O2)、丙二醛 (MDA)3个对细胞有毒性的活性氧指标均高于保持系或杂种F1的花药，同时对活性氧具 有清除作用的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化全(酶(CAT)和过氧化物酶(POD)3个抗氧化 酶活性也随看提高,表明败育初期花药的活性氧增加对抗氧化酶有诱导作用。但在败育盛 期的不育花药中,一方面O2、H2O2和MDA含量极显苦高，另一方面SOD、CAT、POD 酶活性却极显著低，导致活性氧产生与清除失去平衡，这时花粉母细胞大量凋亡。在败育 后的花药中,02和H2O2含量与可育花药相近，但MDA含量仍持续提高，以及SOD、CAT

9、、 POD酶活性持续降低,表明雄性细胞凋广后活性氧对花药仍冇不利影响。花药O2、H2O2 和MDA的过量积累,及其清除酶活性的显著降低，这一过程在棉花不育花药中是与雄性 细胞凋亡同步发生的，但在恢复基因引入后的杂种F1花药中，过量产生的活性氧可被清 除。这表明棉花CMS与花药活性氧代谢异常密切相关。3棉花CMS的分子生物学研究棉花CMS是一种母性遗传性状，受特定的细胞质基因和核内不育基因共同控制，不 育系的细胞质基因组如线粒体基因组、叶绿体基因组与不育花粉的形成密切相关1。在 线粒体基因组方面,线粒体功能的行使是山核基因组和线粒体基因组共同作用的。 Christine13认为口前至少有14个线

10、粒休基因与细胞质不育有关,且共有特征是基因的 开放阅读框由來源于线粒体基因的编码序列、基因的侧翼序列和未知区域的序列共同组 成。线粒体基因组的巫排、突变及线粒体基因的剪切、编辑都可能引起细胞质雄性不育。 2003年,黄晋玲14用合成的线粒体基因组探针(atpA atp6 atp9 cox I cox II和cob) 对晋A胞质不育系和保持系线粒体DNA(mtDNA)进行了限制性片段长度多态性 (restricted fragment length polymorphisms,RFLP)分析，发现 atp6 和 cox II 棊因在两者中的 杂交带型不一致;与保持系相比，呵6和cox II基因在

11、晋A不育系中分别缺少5.7 kb和4.2 kb的强杂交带，并推测条带的缺失可能是mtDNA分了内或分了间重排所致,cox II基因的 变显导致了线粒体功能的失调和雄性不冇。随后她构建了棉花晋A不冇系和保持系的线 粒体文库，获得了晋A不育系和保持系的orfB. cox I和nad4L等3个基因的全序列，通 过比较，证明晋A不育系和保持系在orfB、cox I和nad4L棊因全序列上无差异。此外, 也有人认为棉花CMS可能是由线粒体基因组中新的嵌合阅读框编码一种毒蛋白质，该蛋 白质干扰保守基因的生物活性或者干扰花药发育的生理生化过程，从而中断花粉发育 15。在叶绿体基因组方面，叶绿体基因的变异与棉

12、花胞质不育有关。Chen等16研究认 为，棉花CMS与叶绿体RubisCO大亚基的变异有关。Galau筹17证实，不育系与保持系 之间在叶绿体DNA的限制性酶切片段长度上存在明显差异。在核内基因方面，目前国内 外主要集中在为棉花育性恢复基因相连锁分子标记开发及遗传图谱的精细定位、育性恢 复相关基因的分离克隆等方1们并已取得明显进展。Wang等18利用RAPD、AFLP、STS、 CAPS和SSR标记技术分析了(D8xSG747)xSG747群体,发现了 3个新的RAPD标记和1 个SSR标记，利用PPR基序设计的保守引物与AFLP组合测试回交群体得到一个与恢复 基因Rf2连锁的PPR-AFLP

13、标记,并结合9个与Rf2紧密连锁的分子标记构建了与Rf2 紧密连锁的遗传图谱，由于CIR179250与Rf2和Rfl那紧密连锁，推测Rf2和Rfl都定位 与D亚染色体组的LGD08连锁群上。Zhang等19通过差异展示技术鉴定分离了不携带 恢复基因可育的保持系ARK8518(rf2rf2)n含有D8胞质近等基因系杂合体恢复系 ARK8518(rf2f2)在花药组织中的差异表达棊因。并首次在棉花上阐释了 CMS和其恢复 系的分子机制，特别是淀粉合成酶和PAT基因可能与CMS-D8中的Rf2基因相关。4棉花CMS的育性恢复尽管棉花CMS已经实现“三系”配套，但“三系杂种棉选育进展缓慢。可见，棉花C

14、MS 的育性恢复是实现棉花杂种优势利用的关键。H前获得恢复系的方法主要有:通过远缘 杂交及冋交等手段来获得好的恢复系。如Sheetz等20以恢复系DES-HAF277为母本, 与海岛棉品种PimaS-4朵交,聚合恢复基因Rf和育性增强基因E,育成带有育性增强基因 E的恢复系。利用转棊因等生物工程技术來获得好的恢复系。如王学德等21采用农 杆菌介导法，将谷胱甘肽S-转移酶基因(gst)导入恢复系DES-HAF277中，育成一个对CMS 具有强恢复力的恢复系“浙人强恢S以与胞质雄性不育系具相同遗传背景的可育种质 为原始材料,利用遗传过滤技术培育出胞质雄性不育恢复系。这个方法是范力发等22在 成功培冇出理想的、使Wnafstu胞质不冇系和其的Fl代完全恢复冇性的胞质雄性不冇 恢复系的过程中积累资料的基础上提出来的。5结语综上所述，棉花CMS在细胞学、生理生化、分子生物学和育性恢复方而取得了 一定 的成果，但仍存在着一些问题。如线粒体、叶绿体基因组和核内基因如何影响花粉的发育, 恢复基因与不育基因的作用机理及其克隆都还需进一步研究。随着分子生物学理论和技 术的发展，特别是棉花基因组全测序计划的启动，在不久的将來必将会克隆出许多与棉花 CMS相关基因，从而为棉花CMS的研究打开新的局面。