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1、棉花体细胞胚发生过程的组织细胞学观察曹景林，张献龙j杨细燕，邓锋林，谭家福，郝娟(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室，武汉430070)摘 要：以陆地棉品种Coker 201下胚轴为外植体诱导愈伤纽织，并以介于30-50目筛之间 的胚性愈伤细胞团为材料进行甲个细胞团培养，采用石蜡切片法观察棉花愈伤纽织诱导和分 化过程及体细胞胚发生和发育过程。结果显示棉花胚性愈伤纽织有下胚轴两端发生、内发生、 非胚性细胞转化、外发生和腺体处发生5种形成途径，其中两端发生和内发生是主要的形成 方式；棉花体细胞胚存在单细胞起源，多为表面发生。棉花体细胞胚发育过程中最关键的事 件似卩是极性的建立、顶端分生纽织的形
2、成以及前形成层的分化和生长轴变化。球形胚时期 表皮原层的分化标志着休细胞胚结构分化的开始。初始前形成层的形成是休细胞胚形态转变 的第一个信号。球形胚内部等径细胞轴向延长，接着前形成层生长轴发生变化，这些是心形 胚或椭圆形体胚中的重要事件。鱼雷形胚基本分生纽.织中液泡的出现开始了纽织分化的过 程。对些停滞发育的球形胚和鱼雷形胚的解剖检杳表明，极性建立可能是决沱体细胞胚能 否萌发的关键因索。关键词：棉花；休细胞胚胎发生；纽织细胞学基金项目：教育部新壯纪人才支持计划(NCET-04-0740)作者简介：曹景林(1967-),男，博士，遗传育种专业，现在湖北省烟草科研所工作n*通讯作者(Corresp
3、onding author):张献龙,男,教授,博士生导师。E-mail :xlzhangmciil. hzau. edu. cnHisto-cytological Observation of Somatic Embryogenesis in Cotton (Gossypium hirsutum L.)Cao Jing-lin, Zhang Xian-long, Yang Xi-yan, Deng Feng-lin, Tan Jia-fu, Hao Juan (National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Huazhong Agri
4、cultural University , 430070, Wuhan,Hubei, China)Abstract: Calli were induced from hypocotyl explants of cotton cultivar Coker 201, and individual embryogenic cell clusters with 30-50 mesh sieve, which isolated from embryogenic suspension cultures, were cultured The development of the calli and sing
5、le few-celled aggregates was observed through paraffin sections. The results revealed 5 pathways of embryogenic calli origination including origination from both ends of hypocotyls, origination in inner, differentiation from non-embryonic cells, origination from outer cells of calli, and origination
6、 in the surrounding of gland. Among these, the origination from both ends of hypocotyls and in inner were the most important pathways Cotton somatic embryos originated from individual embryogenic cells, which were in exterior of embryogenic calli in most cases. The most critical events appeared to b
7、e the establishment of apical-basal patterns of symmetry, formation of apical meristems, and differentiation and axial change of procambium during the development of cotton somatic embryos. Differentiation of the protoderm layer marked the beginning of the structural differentiation in globular stag
8、e. Incipient procambium formation was the first sign of somatic embryo transition. Axial elongation of inner isodiametric cells of the globukir somatic embryo followed by the change in the growth axis of the procambium was an important event in heart-shaped or oblong-stage somatic embryo. Vacuolatio
9、n in the ground meristem of torpedo-stage embryo began the process of histodifferentiation. Histological observations of some globular and torpedo-shaped embryos which faired to advance showed that establishment of polarity was the key factor which determined germination of somatic embryos.Keywords:
10、 Cotton; Somatic embryogenesis; histo-cytology体细胞胚胎发生是指与原始组织不存在微管束联系的非合子细胞发育成一-个类似合子 胚的极性结构的过程，它经历了与合子胚发生类似的关键阶段：球形胚、心形胚、鱼雷 形胚和子叶成熟胚山。这个过程也是展示植物细胞如何首先分化然后重新决定向胚性途径发 展而呈现全能性的一种方式。作为20世纪后期植物纽.织培养中的一个重大发现和突破， 体细胞胚胎发生体系在植株再生、病毒脱除、细胞融合、基因工程等领域中具有广泛的应用。 然而，山于不同物种，甚至同一物种的不同基因型在体细胞胚诱导、体细胞胚的同步发育以 及体细胞胚的成熟等各方
11、面对培养条件的要求不同，而使其潜力难以充分发挥。近年來，棉 花体细胞胚胎发生和再生技术得到了明显改进但対棉花体细胞胚胎发生机制的研究较 少I。棉花的再生过程主耍是通过诱导愈伤纽.织产生体细胞胚，山体细胞胚发育成再生苗。 在此过程中了解愈伤纽织和体细胞胚的发生及生长过程対研究棉花体细胞胚的发生机理及 进一步改进再生体系有很大帮助。目前，尽管有一些关于棉花体细胞胚胎发生过程的显微观 察报道68-11-,但系统的纽织学研究报道尚未见到。因此，本研究采用石蜡切片技术，研究 体细胞胚的发生特征，以期从细胞学水平上认识休细胞胚的发生特点，为进一步提高再生效 率研究提供依据。1材料与方法1. 1愈伤组织的诱
12、导和继代培养以陆地棉品种Coker201为供试材料，山华中农业大学棉花育种室提供。棉花品种 Coker201的成熟种子经去壳消毒后,种植在1/2MS培养基上,于281 C下暗培养7 d左右, 获无菌苗。取无菌苗下胚轴切成0.5 cm左右的小段，平放于愈伤诱导培养基(MS无机盐，B5 有机物,0. 45 Pmol L 1 2, 4-D, 0. 46Mmol L 1 KT, 0. 1% (w/v) MgCL 6H?0, 3% (w/v) glucose) 上。诱导35 d左右将愈伤组织转移到2,4-D减半的愈伤诱导培养基上继代培养。以后每28 d 继代1次，直至愈伤组织发生肉眼可见的胚分化。把胚性
13、愈伤纽织转入分化培养基(MS无机盐, 无NH4NO3而KN03加倍,B5有机物,2.46 Mmol L1 IBA , 0. 70 Mmol L_1 KT, 0. 1% (w/v) Glu, 0. 1% (w/v)Asn, 3% (w/v)glucose),每28 d继代1次。愈伤的诱导和分化培养于282C, 光照强度(冷光源)135Mmolnr?sl,每天光照14 h的条件下进行。每两天取一次样放入FAA 固立液中固雄以供组织分析。1.2胚性愈伤组织的悬浮培养胚性愈伤组织继代培养23次后，转入不含激素和Phytagel的分化培养基(补加0. 1% (w/v) KC1)中悬浮培养。首先选収生长稳
14、健、状态疏松的小米粒状米黄色胚性愈伤纽织转 入盛有40 n)L培养基的100 mL锥形瓶(约2 g/瓶)中，温度282C、120 rpm振荡培养2 d,以获得分散的细胞培养物，然后过30目筛，去除大颗粒。然后将每2 mLPCV（packed-cell-volume）胚性愈伤转入盛有40 rnL新鲜培养基的锥形瓶中，继续在温度28 2C下，120 tpm振荡避光培养。每周更换悬浮培养液1次。1.3胚性细胞团的固体培养胚性愈伤组织悬浮培养14 d后，再次过30目筛，滤液再过50目筛，收集筛上部分， 重新悬浮于新鲜培养基中，用- 个长而尖嘴的吸管吸収含愈伤组织的悬浮液均匀喷布在无菌 滤纸上。然后挑取
15、单个的胚性愈伤团转到培养皿中的固体分化培养基（附加2.46 Minol L_1IBA, 0. 70Mmol I? kinetin和0. 1% （w/v） KC1）上继续培养。继代后用封口膜密封,然 后于282 C、光照强度（冷光源）135 Pmolnfs-每天光照14 h的条件下进行培养。 每皿继代20个胚性愈伤团。每两天取样1皿于Leica MZ FUII体视显微镜下检杳胚胎发育 进程，并在不同发育阶段収培养物按愈伤团分别放入FAA固定液中固定以供纟I织分析。每个 阶段开始前后每2 d取样一次固定，缓慢阶段5 d収样一次固定。1. 4石蜡切片制样与观察将待观察的组织取样后放入FAA固定液（福
16、尔马林（formalin）:乙酸（acetic acid）:乙 醇（alcohol）=5:5:90） “中，室温下固定48 h以上。将固定好的纽.织投入苏木精染液中， 染色3d后用蒸饬水漂洗过夜。然后通过以下浓度梯度的乙醉进行脱水：30% 3 h, 50% 3 h, 70% 3 h, 85% 3 h, 95% 1 h, 100% 30 min, 100% 30 min。接着进入以下浓度梯度的二甲 苯进行透明：30%（二甲苯/氯仿）2. 5 h, 50% 2.5 h, 75% 2.5 h, 100% 1 h, 100% 1 h。然 后再在以下梯度浓度的石蜡中浸蜡:15%（石蜡/二甲苯）3 h, 30% 3 h, 50% 2.5 h, 75% 2. 5 h, 100% 50 min, 100% 50 min,最终包埋在100%的石蜡中。包埋好的组织用旋转切片机（KD 2508, KEDEE, China）
