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1、棉花后代群体筛选方式分析转基因植株的筛选鉴定是植物转基因研究的重要环节。目前，转基因棉花筛选鉴定的 常用方法为卡那霉素筛选法和P c R分子检测法1 2 。针对不同试验F1的，这两种方 法相关报道的文献较多，但都有较强的针对性，在实际转基因棉花育种过程中，这两种方法 的应用均存在弊端。卡那霉索筛选法不能反映冃的棊因的表达效果，英筛选结果缺乏可靠性。 PC R分子检测法対试验室要求严格，检测费用昂贵，检测周期长。此外，转基因克隆研究 的发展迅速，不断岀现新的抗虫基因、抗旱基因、抗病基因3,通过外源目的基因表达, 而进行生物测定的筛选方法各不相同，过程复杂，筛选缓慢。特别是近年，随着人规模转基 因
2、研究的相继开展，传统的筛选方法已无法满足大规模转基因后代的高效筛选，尤其是在转 某因杂交育种中，需要在开花前得到准确筛选结果，以便育种操作，传统的筛选方法在效率 上尚略显不足。因此，探索-种快速，准确、较为系统的筛选方法，进行大规模转基因棉花 示代群体的筛选显得尤为重要。木试验结合我国棉花转基因冇种中的两个主流方法4 5 ,以花粉管导入6 外源基因自交系T 1 T 3、转基因杂交育种F 1种子为材料， 探讨田间卡那霉索筛选与P C R分子鉴定相结合,应对大规模转基因棉花后代筛选的可靠性 和实用性，为转皋因棉花后代的筛选鉴定提供参考。1材料与方法1 . 1材料供试品种为绿色棉陇绿棉3号、白色棉陇
3、棉2号、棕色棉B C 0 5 ,均由卄肃省农科院作物所棉花研究室选育、提供，具冇纤维品质优良、产虽稳定等突出性状7 一 8 。转基因鉴定的供试材料为：通过花粉管通道法对陇绿棉3号、BC 0 5导入抗虫 基因 G N A、抗旱基因 G h A B F 2 的 TlT3； W B K 0 9 . 20090713-1 9 7 9分别与陇绿棉3号、E C 0 5、陇棉2号杂交F 1 （GNA、G h AB F 2的基因质 粒、引物序列由中国农科院生物技术研究所提供；WBK 0 9含B t抗虫基因，材料和引物 序列均由中国农科院生物技术研究所提供；20090713-197 9含BADH抗旱基 因，材料
4、和引物序列由新疆农业人学农学院提供），花粉管导入T 1 -T 3材料为海南、敦 煌两地繁育所得，WBK 0 9 . 2 0 0 9 0 7 1 3 - 1 9 7 9与供试品种杂交F 1由海南育 种所得。GNA、GhA B F 2的基因质粒与W BK09、20090713-1979均 携带NPTII标记基因（新霉素磷酸转移酶基因），该基因是目前基因工程中被广泛使用的 选择标记，它对植物细胞表现毒性的机理是：卡那霉素干扰了细胞叶绿体及线粒体的蛋白质 合成，最终导致植物细胞死亡，而转基因植株抑制了这个过程9 一 1 0 。供试材料种植 于卄肃省敦煌市肃州镇隔离试验区。分了鉴定地点为卄肃省农科院生物
5、技术研究所棊因工程 研究索。1 2方法12 . 1卡那霉素浓度梯度试验。设置卡那霉索3 . OgL1、5. OgL1、 7. 0 g L- 1三个处理浓度，在棉花现蕾期，对供试品种顶端倒数笫2片真叶用毛笔涂抹 药液，各处理5 0株，以WBK 0 9做对照（经过PC R分了检测，携带NPTJI标记基因）, 35 d观察统计结果。1. 2. 2卡那霉索抗性植株筛选。在卡那霉素浓度梯度试验的基础上，对转基因供 试材料进行卡那霉索筛选，对筛选后的阳性植株做标记，以备PCR分子检测。1 . 2. 3 P C R分子检测。剪取阳性植株顶端较嫩叶片，采用改良的C T A B大量 提取法1 1 提取纯化基因纟
6、RDNA,针对阳性植株所含不同基因，利用设计好的引物（表 1 ）进行P C R检测。P C R体系所用药剂为F e r m e n t a s公司生产，釆用引物由I n v i t r o g e n公司合成，统计检测结果。2结果与分析2. 1不同品种敏感性及R那霉素筛选条件的确定根据口间观察结果，对棉叶与卡那 霉索处理反应的表现分为三个等级，I级：涂抹叶片正常；I【级：涂抹叶片有轻微变黄；III 级：涂抹叶片具冇黄色斑点（图1）,为了得到可靠的卡那霉索筛选结果，消除棉花叶片自 身对卡那霉素貝有抗性的试验影响，以III级处理结果作为卡那霉素筛选标准。在该筛选标准 下，对试验结果进行统计，结果表
7、明：三种浓度的卡那霉素棉叶涂抹，35 d内，均使陇 棉2号、陇绿棉3号、BC 0 5的棉叶百分Z百转变为具有黄色斑点的叶片；对照W B K 0 9经过浓度为7 . 0 g L 1卡那需素棉叶涂抹，在35 d内，叶片仍未变化。该结果表 明，3. 07. OgL 1卡那霉素叶片涂抹，可以明显区分转基因与非转基因植株。此 外，参试品种在5 . 0 g L- 1卡那霉素叶片涂抹处理下，百分之市转变为具有黄色斑点叶 片，陇棉2号需要3 d , B C 0 5需要4 d ,而陇绿棉3号需要5 d ；因此，可以认为，陇 棉2号棉叶对卡那霉素最为敏感，BC 0 5次Z,陇绿棉3号棉叶为卡那霉素反应最为迟缓。
8、在保证准确性的前捉卜，为了快速得到筛选结果,可以确定陇棉2号的最佳筛选条件为5 . 0g L-1卡那霉素叶片涂抹，03 d观察期；BC 0 5的最佳筛选条件为5 . 0 g L 1 卡那霉索叶片涂抹，04 d观察期；陇绿棉3号的最佳筛选条件为3. 0 g L- 1卡那霉 索叶片涂抹，05 d观察期（见表2 ）。2. 2卡那霉素筛选结果分析在确定卡那霉素筛选最佳条件示，以各品种最佳筛选条 件对相关转基因后代进行间筛选操作，05 d内，共计筛选出8 2 0份叶片未变色的植 株，具中，陇棉2号1 8 1株，陇绿棉3号3 2 4株，B C 0 5 3 1 5株。陇棉2号、陇绿 棉3号、B C 0 5在
9、筛选过程中得到稳定筛选结果的时间分别为第3 d,第4d,第5d（表 3）,该结果表明，针对不同品种确定的最佳筛选条件具有一定的可靠性。由于操作简单， 木次试验仅用5 d完成2 111 2份转基因棉花示代材料的田间筛选，因此，可以认为，田 间卡那霉素筛选可以快速、准确地筛选出具冇卡那霉素抗性的转基因植株。2. 3 PC R分了检测结果分析对8 2 0份阳性植株，进一步进行P C R分了检测， 得到貝备N P T II标记基因的材料8 0 6份，携带目的基因的材料有16 1份，其中转基因 杂交冇种F 1中，有1 5 8份含有目的基因；通过花粉管导入基因的T 1 -T 3材料中，虽 然有2 6 9份
10、材料验证H1NPTII标记棊因，但只有3份材料具备目的基因（表4,图2 ）； 经过多次重复，结果一致。该结果表明：卡那霉索阳性植株筛选的准确率为9 8. 3%,卡 那霉索筛选携带冃的某因的转基因植株准确率为2 0 %；处于连锁状态的标记基因与冃的棊 因，在转慕因育种过程中没冇完全转化或遗传。3结论讨论木试验通过对陇棉2号、陇绿棉3号、BC 0 5非转基因植株进行卡那霉索敏感试验, 以确定III间卡那耀索筛选的最住条件，在此试验基础上，对具相关转基因后代进行川间卡那 霉索初筛，对筛选后的材料进行分了鉴定。试验结果表明，在实际转棊因棉花育种中，应对 大规模转基因棉花后代筛选鉴定，卡那霉素叶片涂抹与
11、目的基因PCR检测相结合，貝-有简 单、快速、准确的特点，是一种高效的筛选方法，具备一定的实用性。在卡那霉素浓度梯度 试验中，不同品种的棉叶对卡那霉素的敏感性不同，与白色棉陇棉2号相比，绿色棉陇绿棉 3号，棕色棉BC 0 5的叶片小，蜡质层较厚，该主理性状彩响叶片与卡那霉索反应。王彦 霞、燕丽萍、李举等12 14在卡那霉素筛选研究小，使用的卡那霉索筛选浓度也各 不相同。因此，不同品种在不同地区做转基因材料田间筛选，要得到准确的筛选结果，必须 进行前期梯度试验。在P C R分了检测试验中，标记基因鉴定结果与目的基因鉴定结果相差 甚远，这种情况在通过花粉管导入后代的材料中尤其明显，祝建波15在硏究
12、过程中也 发现类似情况，并推测原因是：在转基因过程中，标记基因与目的基因在核酸酶的影响下, 形成不完整片段。由于这种原因一般只导致出现个别异常，在木次试验中，试验群体庞大, 不会造成差界如此悬殊的标记基因与目的基因鉴定结果，所以，在本次试验的基础上，推测 原因为：处于连锁状态的标记基因和目的基因在转基因过程中存在分离情况。该推测需要进 一步试验研究进行论证，但试验结果可以明确，卡那霉素筛选准确率低，FI的基因PCR鉴 定才是准确的筛选方法。在人规模转基因棉花育种中，快速、准确的筛选尤为重要。尤具在 转基因杂交育种过程中，需要在开花前得到准确的筛选结果，以便进行亲木选配及杂交组介 的田间操作，此时，如果对转棊因育种T 0进行卡那霉素快速筛选，缩小范围后，再进行准 确的分了鉴定跟踪，可以人规模减少示代群体，提高筛选效率，尽早筛选得到含有目的基因 的转基因材料，加快其后代进行遗传稳定性、基因表达量的研究，缩如安全性中报及产业化进程。棉花后代群体筛选方式分析贵任编辑：陈老师
